过塘蛇药材中没食子酸含量分析

收稿日期:2015-04-28
基金项目:国家科技支撑计划项目(2013BAI11B06);广西科技厅重大专项课题(桂科重1355001-4-1)作者简介:李
兵(1982-),男,广西梧州人,讲师,主要从事中药化学成分及质量控制研究,(电话)159********(电子信箱)gxlb0910@;
通信作者,钟
江,主任医师,主要从事中医及壮医防治皮肤病的研究,(电话)138********(电子信箱)412170126@。

过塘蛇(Jussiaea repens L.)是柳叶菜科水龙属
植物水龙,主要分布于广西、浙江、江西、广东等地,曾收载于《广西中药材标准》,为多种中成药的原料
药[1]。

其味淡,性凉,以干燥全草入药,具有清热、解毒、利尿、消肿之功效,常用于治疗感冒发烧、燥热咳嗽、水肿、喉痛、风火牙痛等症[2]。

目前国内外对过塘蛇研究较少,Marzouk 等[3]发现过塘蛇中广寄生苷的酰化产物具有保肝护肝、抗炎、治疗糖尿病的作用。

张尊听等[4]采用分光光度法测定秦岭太白山20种中草药的乙醇提取液对DPPH ·(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)的清除作用,发现过塘蛇浓度为
0.4mg (干重)/mL 时,对DPPH ·的清除作用高达84.1%,抗氧化作用最强。

没食子酸单体经研究表明具有抗氧化[5]、抗肿瘤[6,7]、抗乙肝病毒[8]、降糖降脂
[9]
等多种生物学活性。

因此,本文采用薄层色谱法对
过塘蛇药材进行定性鉴别,并采用HPLC 法测定过塘蛇药材中指标成分没食子酸的含量,为过塘蛇药材的制剂开发和质量控制提供参考。

1材料与方法
1.1材料与试剂
10批过塘蛇药材均采收于广西不同市县,经广西中医药大学韦松基教授鉴定为柳叶菜科水龙属植物水龙(Jussiaea repens L.)。

没食子酸对照品购于中国食品药品检定研究院(批号110831-201204),甲醇(色谱纯)购于西陇
过塘蛇药材中没食子酸含量分析
李
兵1,陈建惠1,卢汝梅1,农梅冬1,钟江2
(1.广西中医药大学,南宁
530200;2.广西中医药大学第一附属医院,南宁530012)
摘要:为研究过塘蛇(Jussiaea repens L.)药材的质量控制技术,分别采用薄层色谱和液相色谱法分析了过塘蛇样品中活性成分没食子酸含量。

结果表明,薄层色谱法可半定量分析其没食子酸含量,液相色谱法可定量分析没食子酸,其进样量在0.12~0.86μg 之间,与峰面积呈良好线性关系(r =0.9999),平均回收率为97.87%(RSD =0.70%,n =6),10份样品中的没食子酸含量为0.48~2.21mg /g 。

该方法简单可行、重现性好,可用于过塘蛇药材的质量控制。

关键词:过塘蛇(Jussiaea repens L.);没食子酸;药材质量;薄层色谱;液相色谱中图分类号:R917
文献标识码:A
文章编号:0439-8114(2015)14-3508-02
DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.14.045
Analysis of Gallic Acid in the Medical Material of Jussiaea repens L.
LI Bing 1,CHEN Jian-hui 1,LU Ru-mei 1,NONG Mei-dong 1,ZHONG Jiang 2
(1.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,530200;
2.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,530012)
Abstract :The content of gallic acid in Jussiaea repens L.was analyzed by thin layer chromatography
(TLC)and high per⁃
formance liquid chromatography
(HPLC)which provided an index of evaluation for this medical material quality.The results
showed that TLC was a good semi-quantitative analysis for detecting gallic acid in this medical material,and HPLC had a good performance on quantitative analysis gallic acid.In the HPLC analysis,the good linearity in the range of 0.12~0.86μg
(r =0.9999)was obtained.The average recovery reached 97.87%(RSD =0.70%,n =6),the contents of gallic acid in 10samples
were in the range of 0.48~2.21mg /g.The methods are simple,feasible,repeatable for analyzing this medical material quality.Key words :Jussiaea repens L.;gallic acid;medical material quality;TLC;HPLC
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第14期化工股份有限公司,其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器
LC-20A 高效液相色谱仪(日本岛津)1.3方法
1.3.1对照品溶液的制备
称取没食子酸对照品
适量,加甲醇制成1mg /mL 对照品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备取样品粗粉过二号筛,称取粉末
2.0g,置于锥形瓶中,加甲醇50mL,超声
提取30min,过滤,滤液蒸干,残渣加入适量甲醇溶解,作为薄层色谱供试品溶液;称取样品粉末约
2.0000g 置于圆底烧瓶中,加入32mL 水,称定重量,加热回流提取1h,放冷,再称定重量,用水补足损失的重量,摇匀,滤过。

回流提取3次,合并提取液,滤过,收集滤液,待HPLC 分析。

1.3.3薄层色谱分析吸取对照品溶液和10批不
同产地的药材样品溶液适量,分别点于高效薄层硅胶G 板,以乙酸乙酯-氯仿-甲酸(5∶4∶1,V /V /V )为展开剂,展开,取出,晾干,喷5%的磷钼酸乙醇液,在105℃加热至斑点显色清晰。

1.3.4
HPLC 分析Cosmosil C 18柱(5C 18-PAQ,4.6mm×250mm);流动相:甲醇-0.1%磷酸(8∶92,V /V );
检测波长270nm,流速1.0mL /min,柱温为室温。

理论塔板数按没食子酸计算应不少于5000。

2结果与分析
2.1薄层色谱分析
样品的薄层色谱图见图1。

由图1可知,样品与对照品色谱相应的位置(R f =0.5)上,显相同颜色的斑点,重现性较好。

2.2高效液相色谱分析
标准品和样品的HPLC 色谱图见图2。

由图2可知,对照品溶液和供试品溶液在相同的时间内有对应的吸收峰,且峰型对称,无杂峰干扰,理论塔板数按没食子酸计算不少于5000,表明该方法可用于过塘蛇中的没食子酸含量分析。

2.2.1方法学分析分别吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、14.0μL,注入高效液相色谱仪测定,以对照品进样量(μg)为横坐标,对应峰面积为纵坐
标,绘制标准曲线,得回归方程y =3E +06x -7444.7(r =0.9999),结果表明没食子酸进样量在0.12~0.86
μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

吸取没食子酸对照品溶液(61.2μg /mL)10μL,重复进样6次,测定峰面积,计算峰面积的RSD 为0.48%(n =6),表明精密度良好。

取同一批号药材(产地为贺州)6份,每份约2g,按上述方法制备供试品溶液并进行液相色谱分析。

结果表明,没食子酸的平均含量为1.38mg /g (RSD =2.99%,n =6),方法重复性良好。

取同一批号药材(产地为贺州)2g,按上述方法制备供试品溶液,常温分别放置0、2、4、8、12和24h 后,进行液相色谱分析。

结果表明,没食子酸峰面积的RSD 为0.56%(n =6),即供试品溶液在24h 内稳定。

取同一批号药材(产地贺州)约1g,再分别加入浓度为1.53mg /mL(已按干燥品折算)的没食子酸对
照品溶液1mL,同上法处理并计算加样回收率。

结果表明,没食子酸平均回收率为97.87%(RSD =0.73%,n =6,已按干燥品折算),即该法较为准确可靠。

2.2.2不同产地过塘蛇中没食子酸含量的测定将样品按照上述方法处理,每样品设3份平行,经液相色谱分析,外标法计算没食子酸含量,结果见表1。

由表1可知,各产地中过塘蛇中的没食子酸含量为
0.48~2.21mg/g。

3讨论
在制备供试品溶液时,考察了水、无水甲醇和无水乙醇等提取溶剂对结果的影响,也比较了超声、回流和冷浸提取的效果,同时还考察了溶剂倍数对指标成分的影响,结果表明,以水为溶剂,采取回流提取,提取3次,没食子酸的提取率较高。

试验
图1
不同产地过塘蛇药材薄层色谱图
12
34空白5对照678910
图2没食子酸对照品和过塘蛇药材的HPLC 图谱
0.0
2.5 5.0
7.510.012.515.017.5
保留时间//min
1.000.750.500.250.00
检测器A:270nm A.对照品
0.0 2.5 5.07.5
10.012.515.017.5
保留时间//min
6.05.04.03.02.01.00.0检测器A:270nm B 样品(产地贺州)
(下转第3512页)
李兵等:过塘蛇药材中没食子酸含量分析3509
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湖北农业科学
2015年
2.5检出限
按S /N =3计算,9种氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物的检出限分别为:涕灭威亚砜0.02mg /kg,涕灭威砜0.02mg /kg,灭多威0.01mg /kg,三羟基克百威0.02mg /kg,涕灭威0.005mg /kg,克百威0.01mg /kg,甲萘威0.01mg /kg,抗蚜威0.02mg /kg。

3小结
该试验采用乙腈提取蔬菜样品中的目标物,经氨基小柱进行固相萃取净化。

以(乙腈∶甲醇=8∶3,V /V )-水为流动相进行梯度洗脱,流速1.0mL /min,柱温40℃,C 18柱分离,检测波长220nm,可实现蔬菜中8种氨基甲酸酯类农药的检测。

该方法分离效果好、准确度和精密度高,操作简单易行,勿需衍生和荧光检测,适宜基层机构检测蔬菜中多种氨基甲酸酯类农药。

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(责任编辑周有祥)
表1不同产地过塘蛇中没食子酸测定结果
序号123456789
10产地苍梧县桂林永福崇左市钦州小懂镇武鸣县藤县柳州市玉林福绵南宁水街贺州市
批号20130609201309122013102820130927201307172013062120131009201307042013051920130826
含量//mg/g 1.881.591.451.992.211.601.180.481.961.34
同时考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流动相对结果的影响,发现以甲醇-0.1%磷酸水溶液(8∶
92,V /V )为流动相时,保留时间适中,分离度大于1.5,故采用此溶液作为流动相。

该方法快速、准确、灵敏度高、重现性好,对过塘蛇药材的质量控制和进一步制剂研究开发具有参考价值。

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(责任编辑周有祥)
(上接第3509页)
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