苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定
李成亮;都业娟;刘娟娟;石宝萍;向本春
【摘要】[目的]对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定.[方法]通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段.将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析.[结果]苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高.[结论]苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员.
【期刊名称】《新疆农业科学》
【年(卷),期】2013(050)010
【总页数】8页(P1850-1857)
【关键词】苦豆子丛枝病;植原体;16S rRNA基因;16S-23S rRNA间区;tuf基因;分子鉴定
【作者】李成亮;都业娟;刘娟娟;石宝萍;向本春
【作者单位】石河子大学农学院,新疆石河子832003;石河子大学农学院,新疆石河子832003;石河子大学农学院,新疆石河子832003;石河子大学农学院,新疆石河子832003;石河子大学农学院,新疆石河子832003
【正文语种】中文
【中图分类】S435.29
0 引言
【研究意义】植原体（Phytoplasma）原称为类菌质体（MLO），属于柔膜菌纲，在植物和昆虫中广泛分布，是重要的病原微生物。

主要是由取食植物韧皮部的叶蝉、飞虱等昆虫传播，可侵染粮食、蔬菜、药材、林木、花卉、杂草等各类植物。

导致感病植株黄化、顶枯、丛枝、簇生、小叶、矮化、花变叶等症状[1，2]。

目前世界已报道的植原体病害有1 000 多种，我国迄今已报道的植原体病害有100 多种[3]。

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）产于甘肃、新疆、西藏、内蒙古等西北地区，因其含有多种生物碱以及耐盐碱、耐干旱、耐风蚀等优点，被作为我国西北地区重要的药用植物资源和自然植被组成部分，已被纳入国家中药现代化科技产业行动计划，生产基地的建设和深层次开发都有广阔的前景。

由植原体引起的苦豆子病害导致其生长被抑制，全草产量降低，种子颗粒无收，药用化学成分含量降低等，给苦豆子相关产业将造成极大的潜在威胁。

【前人研究进展】由于植原体不能离体培养，所以不能用传统的真菌和细菌的方法进行系统的分类鉴定。

目前，植原体分类的主要依据是分子生物学方法。

例如，植原体的一些保守序列，16S rRNA基因序列、核糖体蛋白基因（rp）、延伸因子（tuf）基因、转运蛋白基因（Sec Y）、16S-23S rRNA间区序列（16S-23S rRNA space region）等，在检测和鉴定中
应用的越来越多[4]。

陈小飞[5]曾利用巢式PCR对采集于新疆天山以南阿拉尔地区的表现黄化症状的苦豆子16S rDNA进行扩增，对扩增出的DNA序列构建系统进化树及虚拟RFLP，鉴定结果为苦豆子黄化植原体，属于16Sr I-B亚组。

【本研究切入点】研究分别利用植原体16S rRNA gene，16S-23S rRNA间区及tuf基因
序列的通用引物对新疆天山以北石河子地区表现丛枝病症状的苦豆子植株总DNA
进行PCR扩增，测序，同源性分析，实现对石河子地区苦豆子丛枝病植原体（Sophora alopecuroides witches′-broom phytoplasma，SAWB）的分子鉴
定。

【拟解决的关键问题】通过对苦豆子丛枝病植原体的分子鉴定，对该病害及时报道，为其检疫工作提供理论与技术支持。

1 材料与方法
1.1 材料
表现植原体感染症状的及无症状的苦豆子样品均采自石河子；克隆载体pMD18-T simple vector购自TaKaRa公司，2×Es Taq Master Mix、琼脂糖凝胶DNA回
收试剂盒及质粒回收试剂盒购自购自北京康为世纪公司；大肠杆菌DH5α，健康
枣树样品及阳性对照枣疯病样品为本实验室保存。

1.2 总DNA提取
参照漆艳香等[6]的方法分别提取感病及健康植株总DNA，-20℃冰箱中保存备用。

1.3 PCR扩增
1.3.1 16S rRNA基因的扩增
利用植原体16S rRNA基因序列通用引物P1/P7[7]和R16F2n/R16R2[8]对样品DNA进行PCR扩增。

以枣疯病病株总DNA为阳性对照，苦豆子及枣树健康植株总DNA为阴性对照，超纯水为空白对照。

先用P1/P7 进行第一轮PCR扩增。

扩增条件为：94℃预处理4 min；94℃45 s，51.5℃50 s，72℃2 min，35 个循环；最后72℃延伸10 min。

取上述各样品PCR产物1 μL作为模板，用
R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增。

扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃45 s，57℃50 s，72℃1.5 min，15 个循环；94℃45 s，65℃50 s，72℃1.5 min，20 个循环；最后72℃，延伸10 min。

表1
1.3.2 tuf基因的扩增
采用Schneider B等[9]设计tuf基因通用引物fTufu/rTufu 对样品DNA进行扩增。

PCR扩增反应条件为：94℃4 min；94℃45 s，52℃，50 s，72℃1 min，
35 个循环；最后72℃延伸10 min。

表1
1.3.3 16S-23S rRNA间区序列的扩增
取以P1/P7 为引物的PCR扩增产物1 μL作为模板，采用植原体16S-23S rRNA 间区通用引物对SR1/SR2[10]进行巢式PCR扩增。

表1
1.4 核苷酸序列的测定与分析
PCR产物回收后连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α，取白色菌落培养并提取质粒。

通过PCR筛选鉴定阳性克隆，送北京华大基因公司进行测序。

所得序列在NCBI中通过Blast搜索同源序列。

利用DNAMAN 6.0 进行核苷酸序列同源性分析，MEGA 5.0 邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建基于16S rRNA基因和tuf基因序列的系统进化树；并利用植原体在线分析软件iPhyClassifier（http：///cgi-
bin/resource/iphyclassifier.cgi）对16S rRNA基因序列进行在线RFLP分析。

表1 用于植原体16S r RNA gene，16S-23S r RNA间区及tuf基因PCR扩增的引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used in PCR amplification of 16S r RNA gene，16S-23S r RNA space region and tuf gene靶序列引物名称引物序列参考文献Target sequencePrimer namePrimer sequence 5′→3′Reference 16S rRNA gene Pl AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA [7]P7 CGTCCTCATCGGCTCTT [7]R16F2n GAAACGACTGCTAAGACTGG [8]R16R2 TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG [8]tuf gene fTufu CCT GAAGAAAGAGAACGTGG [9]rTufu CGGAAATAGAATTGAGGACG [9]16S-23S rRNA space region SR1 AGGCGGATCCTTGGGGTTAAGTCGTAA [10]SR2 AGGCGAATTCCGTCCTCCATCGGCTCT [10]
2 结果与分析
2.1 感病植株症状表现
感病苦豆子表现为丛枝、花器变形、叶子表面出现黄斑、叶脉黄化等症状。

图1
图1 苦豆子丛枝病症状Fig.1 Symptoms of Sophora alopecuroides witches'-broom
2.2 16S rRNA基因及16S-23S rRNA间区序列PCR扩增结果
以P1/P7 为引物直接PCR扩增时，仅阳性对照枣疯病病株总DNA扩增出约1.8 kb 的特异片段，其余均未能扩增出特异片段；以P1/P7 的PCR扩增产物为模板，R16F2n/R16R2 为引物巢式PCR扩增时，仅枣疯病病株和感病苦豆子样品扩增出约为1.2 kb 的特异片段，其余样品均未扩增出特异片段。

以P1/P7 的PCR扩增
产物为模板，SR1/SR2 为引物进行巢式PCR扩增时，扩增出约0.4 kb 的特异片段。

图2
图2 苦豆子丛植病植原体直接PCR及巢式PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of Direct-PCR and Nested-PCR products amplified from Sophora alopecuroides witches′-broom phytoplasmaM：Marker 2000；
1 ～5：直接PCR，引物为P1/P7。

1.枣疯病植原体（阳性对照）；2.健康枣树（阴性对照）；3.苦豆子丛枝病植原体；4.健康苦豆子（阴性对照）；5.双蒸水（空白对照）。

6 ～10：巢式PCR，引物为R16F2n/R16R2。

6.枣疯病植原体（阳性对照）；7.健康枣树（阴性对照）；8.苦豆子丛枝病植原体；9.健康苦豆子（阴性对照）；10.双蒸水（空白对照）M：Marker 2000；1-5：Direct-PCR with primers P1/P7.1.Jujube witches'-broom phytoplasma（positive control）；2.Healthy Jujube（negative control）；3.Sophora alopecuroides witches'-broom phytoplasma；4.Healthy Sophora alopecuroides（negative control）；5.ddH
2 O（control）.6-10：Nested-PCR with primers R16F2n/R16R2.6.Jujube witches' -broom phytoplasma （positive control）；7.Healthy Jujube（negative control）；8.Sophora
alopecuroides witches'-broom phytoplasma；9.Healthy Sophora alopecuroides（negative control）；10.ddH2 O（control）
2.3 tuf基因序列PCR扩增结果
以表现丛枝症状的苦豆子及枣疯病植株总DNA为模板，经PCR扩增得到约0.8 kb 的特异片段，而健康苦豆子植株和双纯水对照未扩增出特异片段。

图3
图3 苦豆子丛枝病植原体tuf基因PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoresis of PCR products amplified from Sophora alopecuroides witches'-broom phytoplasma tuf geneM：Marker 2 000；1.枣疯病植原体（阳性对照）；2.苦豆子丛枝病植原体；3.健康苦豆子；4.双蒸水（对照）M：Marker 2 000；
1.Jujube witches'-broom phytoplasma（positive control）；
2.Sophora alopecuroides witches'-broom phytoplasma；
3.Healthy Sophora alopecuroides（negative control）；
4.ddH2 O（control）
2.4 16S rRNA基因序列分析及系统进化树构建
通过测定SAWB的3 个克隆确定16S rRNA基因扩增片段。

SAWB的16S rRNA 基因含有1 248个核苷酸（Gen Bank 登录号：KC331044），G+C的含量为45.8%。

在NCBI中通过Blast搜索同源性序列显示，与植原体16Sr V-B亚组成员核苷酸序列相似度均在99%以上。

因此初步认为SAWB属于16Sr V-B亚组成员。

利用MEGA 5.0 中Neighbor-Joining法构建系统进化树，SAWB与16Sr V-A、16Sr V-B、16Sr V-C、16Sr V-D、16Sr V-E亚组聚集为同一进化分枝，并与
16Sr V-B亚组的AB052876、FJ457095 和JQ675716 聚为一簇。

图4
2.5 16S rRNA基因序列虚拟RFLP分析
对SAWB的16S rRNA基因序列进行虚拟RFLP分析，结果显示：SAWB与16Sr V-B亚组的参照株系枣疯病植原体（Gen Bank 登录号：AB052876）有相同的酶
切图谱；与16Sr V-A亚组的榆黄化植原体（Gen Bank 登录号：AY197655）在HpaⅡ和Rsa I酶切位点存在差异；与16Sr V-C亚组的金黄色植原体（Gen Bank 登录号：AY197645）在Bfa I、HpaⅡ和Rsa I三个酶切位点存在差异，与
16SrV-D亚组的金黄色植原体（Gen Bank 登录号：AY197644）在Bfa I、BstU I、HpaⅡ和Rsa I四个酶切位点有差异；与16Sr V-E亚组的悬钩子矮化植原体（Gen Bank 登录号：AY197648）在Bfa I、HpaⅡ、Kpn I和Rsa I四个酶切位
点有差异。

图5
图4 基于植原体16S r RNA基因序列分析构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree constructed by parsimony analysis of 16S r RNA gene sequences of phytoplasmas
图5 SAWB及相关亚组植原体16S r RNA基因序列的虚拟RFLP图谱Fig.5 Virtual RFLP patterns of 16S r RNA gene sequences of SAWB and other closely related subgroups①SAWB；②枣疯病植原体（AB052876，16Sr V-B）；③榆黄化植原体（AY197655，16Sr V-A）；④金黄色植原体-C
（AY197645，16Sr V-C）；⑤金黄色植原体-D（AY197644，16Sr V-D）；⑥
悬钩子矮化植原体（AY197648，16Sr V-E）①SAWB；②Jujube witches′-broom phytoplasma（AB052876，16Sr V-B）；③Elm yellows phytoplasma （AY197655，16Sr V-A）；④Flavescence dorée-C（AY197645，16Sr V-C）；
⑤Flavescencedorée-D（AY197644，16Sr V-D）；⑥Rubus stunt phytoplasma（AY197648，16Sr V-E）
2.6 tuf基因序列分析及系统进化树构建
通过测定3 个克隆确定SAWB 的tuf基因扩增片段含824 个核苷酸组成（Gen Bank No.KC479012），G+C含量为33.0%。

与Gene Bank 中的同源序列进行
比较，结果表明：SAWB与16SrV组tuf基因核苷酸相似度均在92%以上。

用
DNAMAN 6.0 进行核苷酸序列同源性分析表明：与我国报道的16Sr V-B亚组枣疯病植原体GU968759、GU137287、GU968760、GU723423、GU723424 同源性达99.6%～100%。

表2
表2 植原体tuf基因核苷酸同源性比较Table 2 Comparison of nucleotide homology of phytoplasma tuf geneGen Bank 登录号植原体16Sr组/亚组核苷酸同源性（%）Gen Bank accession No.Phytoplasma16Sr
grup/subgroupNucleotide homology SAWB Sophora alopecuroides witches'-broom 16SrV 100.0 GU968759 Jujube witches′-broom 16SrV-B 100.0 GU137287 Jujube witches′-broom 16SrV-B 100.0 GU968760 Jujube witches′-broom 16SrV-B 99.9 GU723423 Jujube witches′-broom 16SrV-B 99.9 GU723424 Jujube witches′-broom 16SrV-B 99.6 FN561877 Candidatus Phytoplasma ulmi 16SrV-A 92.7 FN561878 Candidatus Phytoplasma ulmi 16SrV-A 92.7 FN561872 Alder yellows phytoplasma 16SrV-C 92.8
FN561881 Candidatus Phytoplasma vitis 16SrV-C 92.6 AB095673 Tsuwabuki witches′-broom 16SrIII 74.9 AB095674 Western X 16SrIII 75.1 EU413952 Palm lethal yellowing 16SrIV 74.6 AY685053 Candidatus Phytoplasma fraxini 16SrVII 86.1 AF086617 Loofah witches′-broom 16SrVIII 80.0 FJ844444 Mulberry dwarf 16SrI 72.1 DQ096804 Candidatus Phytoplasma australiense 16SrXII 72.5 Y18215 Papaya dieback 16SrXII 73.5 AJ011104 Apple proliferation 16SrX 72.5
利用MEGA 5.0 的Neighbor-Joining法对植原体tuf基因核苷酸序列构建同源进化树。

结果显示：SAWB与16SrV组植原体聚为同一进化分枝，其中与枣疯病植原体GU723424、GU723423、GU968760、GU968759、GU137287 亲缘关系较近，聚为一簇；与FN561877、FN561878、FN561872、FN561881 亲缘关系
较远。

该结果与DNAMAN 6.0 分析的同源性结果一致。

图6
图6 基于19 种植原体株系tuf基因核苷酸序列分析的同源进化树状图Fig.6 Homology tree constructed by parsimony analysis of tuf gene nucleotide sequence from 19 phytoplasmas
2.7 16S-23S rRNA间区序列分析
通过测定3 个克隆确定SAWB的16S-23S rRNA间区序列扩增片段含367 个核
苷酸（Gen Bank No.KC479013），G+C含量为37.9%。

将其与Gene Bank 中的同源序列进行比较分析显示：SAWB与16SrV组核苷酸序列酸相似度在95%～100%，与其他组植原体核苷酸序列酸相似度均低于85%。

3 讨论
陈小飞[5]曾对采集于新疆天山以南阿拉尔地区的表现黄化症状的苦豆子进行检测，结果显示其为苦豆子黄化植原体感染，苦豆子黄化植原体属于16Sr I-B亚组。

研
究在新疆天山以北的石河子地区采集到的苦豆子表现为丛枝、叶子表面有黄斑、花器变形等症状，经检测确定为植原体感染，与苦豆子黄化植原体不同，暂命名为苦豆子丛枝病植原体（SAWB）。

PCR扩增得到16S rRNA基因、16S-23S rRNA
间区及tuf基因序列，分别进行克隆、测序和系统进化树分析。

其中，对tuf基因利用DNAMAN 6.0 进行核苷酸序列同源性分析以及MEGA 5.0 邻接法构建系统
进化树，结果显示SAWB与16Sr V-B亚组的枣疯病亲缘关系最近，这一结果与
对16S rRNA基因序列的分析结果相吻合。

研究表明16Sr V-B亚组植原体在自然条件下能侵染苦豆子，表现的症状却不同于16Sr I-B亚组，同种植物感染植原体
出现不同的症状是因植原体不同还是环境影响导致的原因值得进一步研究。

4 结论
研究利用PCR技术对SAWB的16S rRNA基因，16S-23S rRNA间区序列及tuf 基因扩增分别得到约1.2、0.3 和0.8 kb 特异性片段。

对SAWB 16S rRNA基因
的扩增，巢式PCR优于常规PCR，可以灵敏地检测出苦豆子中是否存在SAWB；SAWB 16S rRNA基因构建系统进化树及虚拟RFLP分析均表明SAWB为16Sr
V-B亚组成员。

对SAWB tuf基因的同源性比较及系统进化树构建均显示：SAWB 与16Sr V-B亚组枣疯病植原体亲缘关系最近。

SAWB的16S-23S rRNA间区序
列与16Sr V成员同源性最高。

通过对3 个基因序列分析，确定新疆石河子地区的苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员。

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