基因表达调控 第三课 mRNA水平的研究9-29

（三）Real-time PCR 实时定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变 化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的 变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定 量分析。
引物设计原则
在NCBI找到目的基因序列，以CDS区进行引物设计。 1.最好位于编码区5′端的300-400bp区域内，可以用DNAman,
（六）原位杂交（in situ hybridization，ISH）
➢ 可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位 ➢ 标 记 探 针 特 异 性 地 与 目 标 靶 mRNA 序 列 杂 交 ， 检 测 标
记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 ➢ 可作为定量分析的补充。
什么情况下选择原位杂交？ 没有合适的抗体，不宜做Western blot检测；样本量太少或比 较复杂，不宜提取RNA或蛋白。
RPA比Northern Blot的优势：
1. 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应 更加完全 2. RPA比Northern Blot灵敏15-150倍，适合检测各种表 达水平之基因 3. RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一 情况下的差异表达 4. 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加 快研究速度
➢ 基本原理：
将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的 RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的 RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化； 而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化 形成寡核糖核酸。
RPA基本程序：
➢ 待测RNA的分离 ➢ 体外转录标记RNA探针 ➢ 待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ➢ RNA酶消化 ➢ 不同大小杂交片段凝胶电泳分离
基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本 之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处 理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达 差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。
基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。
A
B
Real-time PCR
RT PCR
定量PCR引物设计软件：
Primer bank
（四）Northern blot
将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继 而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和 用探针进行杂交检测。
Northern blot主要用于检测样品中是否含有基 因的转录产物（mRNA）及其含量。
Northern blot 流程图
Northern blot
RNA浓度和纯度检测 A260/A280 表示质量（一般在1.8-2.0），A260表示数量。 RNA完整度检测 28S RNA大小一般为5 kb，18S RNA 大小一般为2 kb。28S RNA 的亮度一般是18S 的两倍。
RNA琼脂糖凝胶电泳
（二）RT-PCR（半定量PCR）
RT-PCR相关试剂
The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between trans-acting polyadenylation factors and cis-elements present in the pre-mRNAs, such as the central sequence motif AAUAAA.
差异显示RT-PCR(different display reverse transcription PCR， DDRT-PCR)，1992
基因表达的系列分析(serial analysis of gene expression， SAGE)，1995
抑制性差减杂交(ppression subtractive hybridisation，SSH)， 1996
32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；
生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后， 电转移至尼龙膜，用链霉亲和素－辣根过氧化物酶 和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合， X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。
核糖核酸酶保护实验原理示意图
Most mRNA regulatory elements are situated within the 5’ and 3’untranslated regions (UTRs).
The mRNA stability is regulated by the complex interplay of cis-acting equences within the 3’UTR of the mRNA and trans-acting factors, such as RNA binding proteins (RBPs) and regulatory RNAs (microRNA and long non coding RNA that bind directly or indirectly to the cisacting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.
基因芯片(gene chip or micrOarray)
基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)分析
（八）mRNA稳定性分析
转录抑制剂： actinomycin D (ActD), 放线菌素D 5,6-dichloro-1–D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB), α-amanitin (α-Am)
Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变 剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的 处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。
（五）核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA）
➢ 是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法
反转录引物
注意事项：
1．防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 2. 避免gDNA的污染，用DNase处理。 3．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 4．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参 有 GAPDH、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及 各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 5. 稀释cDNA，内参循环数20-26。 6. 扩增产物长度300-500 bp。
一、RNA研究策略和方法
RT-PCR, Real-time PCR， Northern blot, RNA酶保护实验, 差异筛选， 基因芯片
（一）RNA的提取
Total RNA：rRNA约占80％-85％，tRNA和核内小分子 RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，琼脂糖凝胶电泳 中只能看到：28S，18S，5S。
提取用试剂：Trizol reagent
RNA提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase
的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止 手、唾液和空气中RNase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、 移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌 15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase，可以 不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品 经常有RNase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃 器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）
优点：northern blot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于 它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化； 与定量PCR的高灵敏度相比，northern blot较高的特异性可以有效 的减少实验结果的假阳性。
缺点： Northern blot 实验中要防止RNA的降解，所有实验用品都需要经 过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时， northern blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人 体都有一定的伤害。
原位杂交技术主要步骤：
• 材料处理及细胞样品的固定； • 样品的制备和预处理； • 探针的制备和预杂交； • 探针及样品的变性； • 杂交温育； • 检测杂交信号，进行结果分析。
（七）差异表达基因筛选方法
表达序列标签(expressed sequencing tag，EST) 技术，1991
8. 引物3′端要避开密码子的第3位。 9. 荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 10. 最好跨内含子。 11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％。 12.TM值在55-63度之间。
Real-time PCR的应用：
DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物 或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数 的检测，RNAi 基因失活率的检测等。
mRNA分析技术
基因表达
基因
mRNA 蛋白质多肽链
基因表达的变化可以两个水平进行分析：mRNA 水平 和蛋白质水平
mRNA表达变化的检测方法：Northern blot, RTPCR(半定量PCR), Real-time PCR (定量PCR), 荧光原 位杂交等、基因芯片、高通量测序等
mRNA 表达变化的机制的研究方法方法有：启动子活性分 析（转录水平分析）、mRNA转录效率分析（Nuclear run on）、mRNA稳定性检测（转录后水平）
AU-rich element RNAbinding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP) , KH-type splicing regulatory protein (KSRP)
embryonic lethal abnormal vision (ELAV)-like protein 1 (HuR) and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2)
（3）Alternative polyadenylation (APA)
APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3’ end of the nascent transcript. This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability.
（2）Regulatory non-coding RNA
miRNAs act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression.
lncRNAs show different mechanism of action, varying from chromatin remodeling, transcriptional responses and RNA processing.
Alignment 软件看看结果。 2.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 3.G+C含量在40%-60%之间，45-55％最佳。 4.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 5.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 6.引物5′端可以修饰。
7. 3′端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich 的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
荧光素酶报告基因分析系统
二、mRNA稳定性调节的机制
（1）AU-rich sequences and mRNA binding proteins
AU-rich elements (AREs) : AUUUA, 7-9% of cellular mRNAs
These elements are recognized by trans-acting factors, such as mRNA-binding proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.