叶绿素分离,提取与含量测定

叶绿素提取、分离与测定
曹志凡141140003
一．实验目的
1、了解叶绿体色素的构成；
2、了解叶绿素的某些物理及化学性质，掌握提取叶绿素及分离叶绿素的原理；
3、了解纸层析法分离色素的实验原理
4、学会用纸层析的方法分离叶绿体色素；
5、初步学习用分光光度计测定叶绿素ab含量。

二．实验原理
1.植物叶绿体色素是吸收太阳光能,进行光合作用的重要物质.它一般由叶绿素a,叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体。

2.绿色素（包括叶绿素a蓝绿色和叶绿素b黄绿色）和黄色素（包括胡萝卜素黄色和叶黄素橙黄色）这两类色素都很难溶于水，而易溶于有机溶剂,故可用乙醇,丙酮等有机溶剂提取。

3.由于光合色素位于叶绿体中的类囊体上，要把它提取出来必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，以便充分提取色素。

4.叶绿素是一种含镁的化合物，其中的镁易被H+、Cu2+、Zn2+等取代。

当被H+取代后，就形成去镁叶绿素，呈黄褐色。

虽然研磨过程中不发生产生大量H+的化学反应，但液泡中常含有多种有机酸。

一般认为，碳酸钙的作用在于中和研磨过程中产生的H+，以防止叶绿素被破坏。

5.纸层析法又称纸色谱法。

以纸为载体的色谱法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。

根据不同色素在层析液中的溶解度不同造成随层析液扩散速度不同这一原理进行分离。

6.当层析溶剂不断从纸上流过时,由于混合物(叶绿素提取液)中各种成分在固定相和流动相间溶解度和吸附能力不同而具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后,可将各种色素分开，其中胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，其次是叶黄素、叶绿素a，叶绿素b溶解度最低，扩散得最慢。

7.分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度，样品的吸光值与样品的浓度成正比。

8.叶绿体色素及胡萝卜素都有一定的光学活性，表现出一定的吸收光谱，可以用分光光度计精确测定。

9.叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠，根据Lambert—Beer定律，如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得
到两种组分的含量。

10.根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系 (1)A1=Ca·ka1+Cb·kb1
(2)A2=Ca·ka2+Cb·kb2
（Ca为组分a的浓度，g/L，Cb为组分b的浓度，g/L，A1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。

A2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值，ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的吸光度A值，kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的吸光度A值，ka2为组分a（浓度为1g/L）在波长λ2时的吸光度A值，kb1为组分b（浓度为1g/L）在波长λ1时的吸光度A值）
三．实验的试剂与器材
1.实验材料：菠菜或青菜叶片。

2.实验试剂：无水乙醇或丙酮，石英砂，碳酸钙粉，层析液: 石油醚10ml+丙酮2ml+苯1ml（有毒）。

3.实验器材：研钵，漏斗，小烧杯，剪刀，滴管, 滤纸，脱脂棉，毛细管，吸水纸。

四．实验步骤
1.叶绿体色素的提取
（1）取植物新鲜叶片2 g,洗净,擦干,去掉粗的叶脉，剪碎,放入研钵中；
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉, 研磨至近乎糊状，加入10-15mL 无水乙醇,再研磨片刻，提取3-5 min，然后用漏斗（内放一层薄的脱脂棉）过滤,即得色素提取液。

2.叶绿体色素的分离
（1）制备滤纸条：剪去一端两角，在距离剪角一端1～ 1.5 cm处用铅笔画线
（或简单做个记号）。

（2） 画滤液细线：用毛细吸管吸收少量滤液，沿铅笔线（记号）处均匀地画一条直的滤液细线。

干燥后，连续重复3～5次，至滤液细线呈绿色。

（3）分离色素：倒入层析冻存管2～3 ml 层析液，适当调节层析液液面，以放入滤纸条后样品线至少稍稍高出滤液为宜。

以将滤纸条尖端朝下略微斜靠烧杯内壁，轻轻插入层析液，旋紧盖子。

（4）观察实验结果并记录实验现象：当推动剂前沿接近滤纸上端边缘时，取出滤纸，自然晾干，观察色带的分布：四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素(橙黄色)>叶黄素(黄色)>叶绿素a(蓝绿色)>叶绿素b(黄绿色) 。

用铅笔标出各种色素的位置和名称。

4.利用分光光度计测定叶绿体各组分的含量：
（1）打开电源，开动仪器预热20分钟，仪器自检完毕，显示正常。

（2）设定两组波长，分别是663nm 与645nm ，调零后，自动进样检测样品。

（3）记录实验数据并重复实验三次。

五．实验结果
1.叶绿体色素分离所得到的实验结果图（两组）
胡萝卜素 胡萝卜素
叶黄素 叶黄素
叶绿素a 叶绿素a
叶绿素b 叶绿素b
2.用分光光度计测得的实验结果（三组） 项目 实验组别 在645nm 的波长的光下吸光度A645 在663nm 的波长的光下的吸光度A663 计算出的叶绿素a 的含量 (g/L) 计算出的叶绿素b 的含量 (g/L) 第一组 2.505
3.117 0.03285 0.04278
第二组 2.495 3.078 0.03238 0.04273
第三组 2.500 3.114 0.03282 0.04268
最终得到的实验结果为叶绿素a的含量是Ca=0.03268g/L，叶绿素b的含量为Cb=0.04273g/L。

六．实验结论
1.高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种。

它们不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。

叶绿素a分子式：
C55H72O5N4Mg；叶绿素 b分子式：C55H70O6N4Mg。

在颜色上，叶绿素a 呈蓝绿色，而叶绿素b 呈黄绿色。

按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。

叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。

叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。

酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。

叶绿素溶液能进行部分类似光合作用的反应，在光下使某些化合物氧化或还原。

2.叶绿素的荧光现象：叶绿素的可见光波段的吸收光谱，在蓝光和红光处各有一显著的吸收峰。

吸收峰的位置和消光值的大小随叶绿素种类不同而有所不同。

叶绿素a最大的吸收光的波长在420-663nm，叶绿素b 的最大吸收波长范围在460-645nm。

当叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光吸收的特性稍有改变。

叶绿素的酒精溶液在透射光下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。

这个红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。

这个现象就是荧光现象。

其主要原理是由于叶绿素有两个不同的吸收峰。

叶绿素吸收光的能力极强，如果把叶绿素的丙酮提取液放在光源与分光镜之间，可以看到光谱中有些波长的光被吸收了。

因此，在光谱上就出现了黑线或暗带，这种光谱叫吸收光谱。

叶绿素吸收光谱的最强区域有两个：一个是在波长为640nm-660nm的红光部分，另一个在波长为430nm-450nm的蓝紫光部分。

对其他光吸收较少，其中对绿光吸收最少，由于叶绿素吸收绿光最少，所以叶绿素的溶液呈绿色。

叶绿素的丙酮提取液在透射光下是翠绿色的，而在反射光下是棕红色的。

3.胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a 、叶绿素 b这四种色素在层析液中的溶解度依次降低，溶解度越大扩散越快，可知滤纸条上会出现四条色素带。

4.该实验成功的关键：
（1）叶片新鲜，颜色要深绿，含有较多色素。

（2）研磨要迅速、充分。

叶绿素不稳定，易被细胞内有机酸破坏。

充分研磨使叶绿体完全破裂，提取较多的色素。

（3）滤液细线要画得细而直，以防止色素带重叠。

且要重复2-3次，以增加色素量，使色素带更加清晰。

(4)滤液细线不能触及层析液，否则滤液细线上的色素会溶解到层析液中，滤纸条上得不到色素带。

5.制备滤纸条时，根据边缘扩散原理，物质分子沿边缘扩散速度要大于里边扩散的速度，因此要将滤纸条的一端剪去两角，主要是为了延长边缘长度，这样可以使色素在滤纸条上扩散均匀，便于观察实验结果。

七．问题解答
1.实验中有哪些注意事项？
答：①取材时要选取新鲜的颜色较深的叶片，是因为以便使滤液中含较多的色素；
②研磨时加入石英砂的目的是为了研磨得充分，更有效地破坏细胞结构；但由于二氧化硅粉是特别细的白色粉末，再加上控制不好用量，易过量，使滤液中含有较多的二氧化硅，而导致滤液颜色变浅。

滤液中杂质越多，实验现象越不明显。

③加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。

因为叶绿素分子结构中含有一个镁原子，当细胞破裂时，细胞液内有机酸中的氢可取代镁原子而成为褐色的去镁叶绿素，碳酸钙可中和有机酸以防止去镁反应的发生。

④研磨要迅速、充分。

这是因为一是因为提取液容易挥发；二是为了使叶绿体完全破裂，从而能提取较多的色素；三是叶绿素极不稳定，能被活细胞中的叶绿素酶水解而破坏。

迅速和充分是存在着一定冲突的两种要求，在实验中，可采用先不加提取液，研磨几分钟后再加入提取液。

⑤用分光光度计测量叶绿素组分的含量有时会超过仪器的量程，这时需要先稀释后再进行检测。

⑥画线时，一定要细并且直，这样可以防止色素带重叠，使色素分子均匀分布在一条直线上，做到扩散起点一致。

重复划2-3次，是为了增加滤液细线上的色素分子数量，使实验效果更加明显。

⑦分离色素时，一定不要让滤纸条上的滤液细线没及到层析液，这是因为色素易溶解于层析液中，导致色素带不清晰，影响实验效果。

2.各种色素在光合作用中的作用。

答：叶绿体中的色素有两种：叶绿素a与叶绿素b,其中叶绿素a主要吸收可见光中的蓝紫光和红光，叶绿素b主要吸收可见光中的蓝光和橙色光。

直接参与光合作用的只有叶绿素a，叶绿素b吸收的光要传递给叶绿素a后才能被利用，所以叶绿素b为辅助色素，类胡萝卜素所吸收的光也是传递给叶绿素a后起作用，所以累胡萝卜素也是辅助色素。

它们具有保护叶绿素的作用，在强光下吸收并耗散多余的光能。

作用中心的一个叶绿素a分子在接受各种其他色素传来的光能后，能够激发电子，并传给原初电子受体，维持光合电子传递链在两个光系统之间的进行。

两个光系统的叶绿素a吸收高峰的光波长不同关键在于与叶绿素a
结合的蛋白质的种类不同。

3.分光光度计出现的读数漂移现象的改善。

答:灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。

这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。

另外，还需考虑试样本身物化性质和溶解试样的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，可大大稳定读数。

样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，这些小颗粒的存在干扰测试效果。

因此要控制好研磨时碳酸钙和二氧化硅的用量。

最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的
最小体积等多个操作事项。

八．实验小结
实验中由于第一次分离叶绿素时，画滤液细线的次数不够，导致色素带不够清楚，第二次重复画了几次，实验效果明显好于第一组实验
九．参考文献
《陈阅增普通生物学》吴相钰、王守良、葛明德编写高等教育出版社《生物化学与分子生物学实验技术》杨安钢，刘新平，药立波编写高等教育出版社。