中性粒细胞的分离

中性粒细胞的细胞外操作：如何获取和显现
背景
中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞。

作为专职吞噬细胞，他们吞噬细菌，通过吞噬体与抗菌颗粒融合后在细胞内杀死细菌。

我们发现中性粒细胞还有另一种杀死微生物的方式：经过活化后，中性粒细胞释放颗粒酶和核染色质，它们一起可以在细胞外形成纤维结合病原体。

这些新奇的结构，或者称为中性粒细胞外陷阱（NETs）降低毒性，杀伤细菌、真菌、寄生虫。

NETs的骨架结构是DNA，而且它们可以在DNA酶的作用下迅速分解。

因此表达DNA酶的细菌更具有毒性，中性粒细胞的细胞核将会失去它们原有的形状和异染色质变得均一。

接着，核膜和颗粒膜分解，使得NET的组分混合。

最后，细胞膜破裂，NETs 被释放。

这个细胞死亡程序不同于凋亡和坏死，它依赖于NADPH氧化酶催化形成的活性氧。

中性粒细胞的细胞外陷阱咋急性炎症反应中很常见。

NETs是固有免疫反应的一种形式，它们结合微生物，阻止他们扩散，并且保持抗菌介质在局部的高浓度是毒性降低、杀死病原体，这让中性粒细胞即使死亡也可以执行抗菌功能。

现在有越来越多的证据证
明NETs参与多种疾病，包括自身免疫病和不孕症等。

我们描述了从人类外周血中分离中性粒细胞和刺激他们产生NETs的方法，以及通过光镜和电镜观察的步骤。

1、
从人类外周血中分离中性粒细胞
Histopaque 1119 PBS Percoll 10x PBS
使用经EDTA或者肝素（10U/ml）抗凝的24ml人血。

1.
向15ml离心管中加入6ml Histopaque 1119，小心地叠加5~7ml全血
2.
离心二十分钟800xg
3.
弃去上层黄色清亮的上层液体，将下层红色层（红细胞和粒细胞）转移至新的离心管4.
通过在离心管中加满PBS清洗细胞，离心10分钟300xg
5.
同时，混合18 ml Percoll和2ml 10x PBS制备100% Percoll溶液。

再用1x PBS制备85%,80%,75%,70%,65% Percoll液各4ml
6.
准备两只离心管，按降序叠加浓度梯度的Percoll溶液各2ml（高浓度在下层低浓度在上层）
离心后弃去上层清液，用4ml PBS溶解沉淀使细胞重新悬挂
7.
8.
向两只离心管中小心叠加2ml悬浊液于梯度液上
9.
离心800xg二十分钟
10.
离心后，将顶层液体，包含大部分的PBMCs的65%层液体，分界层的白色物质，一直到85%层液体之前的液体转移至新的离心管中
11.
通过用装满PBS的离心管离心10min 300xg的方法来洗细胞
12.
移去上层清液，用2ml的PBS使底层细胞（通常>95%是PMN）重新悬浮悬浮
用血细胞计数器数细胞
13.
中性粒细胞的分离二
中性粒细胞分离液 HBSS（不含Ca2+/Mg2+）红细胞裂解液 HBSS/HSA溶液（2%HSA）
1.将所有试剂置于室温。

2.取5.0ml中性粒细胞分离液于离心管中，在分离液上小心叠加血液5.0ml（缓慢小心操作，吸管的吸头尽量靠近分离液表面，防止血与分离液混合）。

3.在20-25°C，500RCF ，离心35min。

血液被分为6层（从上到下）：血浆，单核细胞，分离液，中性粒细胞，分离液（较前一层厚），以及红血细胞沉淀。

若分离不完全，需重做，直至有清晰的分界线
4.弃去上3层溶液（吸管）
5.吸取中性粒细胞层及其下层分离液于洁净的离心管中。

（不要接触红细胞层）
6.用不含Ca2+/Mg2+的HBSS稀释中心粒细胞溶液到10ml。

翻转数次使细胞悬浮。

7. 350 RCF，离心10分钟。

离心管底部出现红色附着物（包含中性粒细胞及剩余的红细胞），用吸管小心吸走上清液。

8.加入2ml红细胞裂解液，裂解剩余的红细胞。

振荡器设置在3~4，振荡数秒或间断振荡使细胞重新悬浮（不振荡器设置不超过4，否则可能活化中性粒细胞。

）
9.250 RCF，离心5分钟。

弃去上清液。

（若有必要，重复8）
10.于各试管中加入500ul不含Ca2+/Mg2+的HBSS。

用振荡器（3~4档）使细胞再次悬浮。

用不含Ca2+/Mg2+的HBSS稀释至10ml。

11.250 RCF，离心5分钟。

用吸管小心弃去上清液。

12.用250ul HBSS/HSA溶液（2%HSA）使细胞再次悬浮。

细胞计数，调节至所需浓度。