基于纳米银-曙红Y-DNA的荧光共振能量转移探针

基于纳米银-曙红Y-DNA的荧光共振能量转移探针
魏光成;闫苗苗;马丽英
【摘要】The resonance energy transfer between nano-Ag and eosin Y （EY）-DNA was studied by UV-Vis spectrophotometry, fluorospectrophotometry and electrophoresis with EY-DNA as fluorescence probe. The phenomenon of interaction between nano-Ag and EY-DNA was explained by the theory of fluorescence resonance energy transfer （FRET）. It was found that the reaction of EY with DNA was due to inserting action, and the reaction between nano Ag and DNA was due to electrostatic action. The structure of DNA was changed after binding with EY and nano-Ag.%以曙红Y—DNA为荧光探针，运用紫外可见光谱法、荧光光谱法和电泳法研究了纳米银与曙红Y—DNA之间的共振能量转移，并应用能量共振转移的原理解释了纳米银及曙红Y与DNA之间的相互作用。

结果表明，曙红Y 与DNA的作用方式为嵌插作用，纳米银与DNA的作用方式为静电作用，曙红Y 和纳米银结合到DNA上以后，导致了DNA结构的改变。

【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2012(048)006
【总页数】4页(P643-645,648)
【关键词】纳米银;DNA;曙红Y;荧光共振能量转移;探针
【作者】魏光成;闫苗苗;马丽英
【作者单位】滨州医学院药学院,烟台264003;滨州医学院药学院,烟台264003;滨
州医学院药学院,烟台264003
【正文语种】中文
【中图分类】O657.3
近年来，量子点和缩氨酸、DNA以及蛋白质相结合的复合体在纳米生物技术和纳
米药物领域引起了科学家的极大兴趣和广泛关注［1－2］。

它作为一类新型的纳
米荧光探针，具有荧光效率高、发光覆盖范围广和光学性质稳定等特点，在生命活动检测及长时间活体示踪等方面具有独特优势［3－5］。

但有文献报道，量子点
作为荧光共振能量转移（FRET）受体几乎看不到能量的转移，主要与量子点长的
激活寿命和受体染料分子短暂的激发时间有关［6－7］。

FRET是一种
非辐射能量跃迁，通过分子间电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随荧光寿命的相应缩短或延长。

这种技术已在生物大分子相互作用研究、免疫分析、纳米传感器设计等领域得到应用［8－9］。

本工作用曙红Y和DNA结合作为荧光探针，研究结合了曙红Y的DNA与量子给体纳米银颗粒之间的能量共振转移。

756PC型紫外－可见分光光度计；Perkin－Elmer－LS 55型荧光分光光度计；DYY－2C型电泳仪；6G2009－0325型自动CCD凝胶成像系统；CL－2型恒温
加热磁力搅拌器。

0.5 ×TBE缓冲溶液：取三羟甲基氨基甲烷（Tris）5.4g，硼酸2.75g，pH 8.0的0.5mol·L－1 EDTA溶液2mL，加水后搅拌溶解，将溶液定容至1L后，调pH 8.0，高温高压灭菌，于4℃保存。

曙红Y溶液：称取曙红Y（EY）0.062 4g于100mL容量瓶中，加水定容至
100mL，浓度为9×10－4 mol·L－1。

使用时用水稀释为9×10－6 mol·L－1曙
红Y溶液。

DNA溶液：移取2.0×10－2 mol·L－1 DNA溶液10μL于10mL比色管中，加水稀释至10mL，即得2.0×10－5 mol·L－1 DNA溶液。

纳米银溶液［10］：称取硝酸银30.0mg于1L水中充分溶解，加热至沸腾。

在加热和强力搅拌下滴加10g·L－1柠檬酸钠溶液6滴，继续搅拌，保持沸腾2min后，再连续滴加柠檬酸钠溶液至总滴加量为2mL时，停止滴加，继续搅拌、加热，保持溶液沸腾5min。

继续搅拌至室温，得到黄色的纳米银溶液，浓度为2.0×10－4 mol·L－1。

试验用水为超纯水。

1.2.1 紫外可见光谱及荧光光谱的测定
依次移取9.0×10－6 mol·L－1曙红 Y溶液及2.0×10－4 mol·L－1纳米银溶液适量，分别用紫外－可见分光光度计和荧光光度计测定吸收光谱和荧光光谱（激发波长253nm），研究纳米银颗粒和曙红Y荧光能量共振转移。

为了研究纳米银－曙红Y－DNA体系的荧光能量共振转移及共振效率问题，以
253nm为激发波长测定其荧光光谱。

1.2.2 电泳
在100V下进行电泳试验，电泳50min后，取出胶片放入溴化乙锭（EB）溶液中染色5min，而后拍照观察，研究纳米银、曙红Y对DNA的影响。

曙红Y和纳米银的紫外吸收光谱和荧光光谱图见图1。

由图1可知：曙红Y的紫外吸收波长517nm（曲线2）与纳米银的发射光谱
519nm（曲线3）有很大程度的重叠，表明纳米银与曙红Y之间会发生有效的共
振能量转移，当纳米银与曙红Y－DNA距离在几个波长之内时，外层曙红Y分子
吸收由纳米银发出的非辐射性能量而发出一定波长的荧光，由于曙红Y本身可以
发荧光，故表现为荧光强度的增强；而作为供体的纳米银能级落回到基态。

纳米银－曙红 Y－DNA体系的荧光光谱图见图2。

由图2可以看出：在一定范围内，随DNA／纳米银物质的量的比减小，纳米银的荧光强度减弱，而曙红Y的荧光强度增强。

随DNA加入量减少，曙红Y／DNA
的比增加，因此结合到单位DNA上的曙红Y不断增多；由于纳米银的量不变，而DNA的量减少了，所以结合到单位DNA上的纳米银不断增多，碰撞距离内的纳
米银和曙红Y的量增多，纳米银吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，能量向邻近的曙红Y分子转移的越多，致使纳米银本身的荧光强度降低，而曙红Y会发射出更多的光子，表现为曙
红Y的荧光强度不断增强。

以IA／（IA＋ID）评价荧光共振能量转移的效率，IA和ID分别为受体和供体的
荧光强度，DNA与纳米银物质的量的比不同时对荧光效率的影响，见图3。

由图3可以看出：随着DNA／纳米银物质的量的比不断减小，荧光能量共振转移的效率不断增强。

说明在一定的范围内，DNA的含量越少，荧光共振转移效率越高。

因为一条DNA链可以结合很多的纳米银颗粒，也可以结合很多的曙红Y，由于试验中固定了纳米银的量，当DNA的含量减小时，曙红Y的含量就相应增大，曙红Y就会相对稠密地结合到DNA上，纳米银颗粒也会相对稠密地结合到DNA 上，那么，碰撞距离内的纳米银与曙红Y－DNA的量就会增多，致使荧光共振转
移效率逐渐增大。

图4为曙红Y和纳米银对DNA影响的电泳图。

泳道1为曙红Y和纳米银的电泳图，没有带；泳道2为结合了纳米银颗粒的质粒DNA的电泳图，由于纳米银微粒与DNA的磷酸基结合，中和了DNA的一部分
负电荷，使DNA移动速率减慢，表现为泳道2的a带，由于试验中纳米银颗粒的量比DNA的量少很多，有一些DNA没有结合纳米银颗粒而移动速率不变，表现
为泳道2的b带；泳道3为结合了纳米银颗粒和曙红Y的电泳图，也出现了两条带，其中d带为DNA带，c带为结合了纳米银颗粒和曙红Y的带，由于曙红Y在水中离解成带负电的有色色酸部分和带正电荷的无色的钠离子部分，带负电的有色色酸部分与DNA中的碱基对相互作用以嵌插的方式结合到DNA上［11］，从而改变了DNA的结构，使其移动速率减慢，表现为c带；泳道4为质粒DNA的电泳图。

本工作用光谱和电泳方法解释了纳米银与曙红Y（已经与DNA结合）发生共振能量转移的原因。

试验结果显示：曙红Y与DNA的作用方式为嵌插作用，纳米银与DNA的作用方式为静电作用。

曙红Y和纳米银结合到DNA上以后，导致了DNA 结构的改变。

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