人参皂苷Rb1对缺氧复氧心肌细胞线粒体融合与分裂的影响

人参皂苷Rb1对缺氧/复氧心肌细胞线粒体融合与分裂的影响
杨轶1,2 麦丽萍1 刘晓颖1陈少贤1余细勇1 杨敏1,2*
(1.广东省人民医院广东省医学科学院医学研究部，广东广州 510080；2. 广东
省医学科学院广东省人民医院药学部，广东广州 51008)
摘要：目的探讨人参皂苷Rb1对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用及其对线粒体融合与分裂的影响。

方法采用安宁包缺氧体系构建原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，并给予Rb1干预，实验分为正常对照组，缺氧/复氧6h组，缺氧/复氧12h组，缺氧/复氧24h组，Rb1-50μM组(缺氧/复氧+Rb1-50μM)，Rb1-200μM 组(缺氧/复氧+Rb1-200μM)，通过流式细胞术检测凋亡率与ROS水平、real time PCR检测线粒体融合与分裂有关mRNA表达水平、western blot 检测Drp1以及p53蛋白水平、通过激光共聚焦显微镜观察线粒体形态变化。

结果缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡(60.7%±2.0%)，Rb1(50μM, 200μM)处理可降低缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡率(41.0%±3.5%,***P＜0.001;31.9%±1.5%,***P＜0.001)；与正常对照组(218.9±10.5)相比，缺氧/复氧组ROS水平升高(369.7±48.0,**P＜0.01)，Rb1组ROS水平(270.9±9.9,*P＜0.05)；与正常对照组相比，缺氧/复氧组Drp1 mRNA水平上升了约3倍(3.3±0.5,▲▲▲P＜0.001)，而Fis1, Mfn1, Opa1 mRNA表达水平没有变化，Rb1可降低缺氧/复氧心肌细胞Drp1mRNA表达水平(2.4%±0.3%,▲P＜0.05)，而对Fis1, Mfn1, Opa1 mRNA表达没有影响；缺氧/复氧诱导Drp1蛋白水平升高(4.6%±0.2%,***P＜0.001)、p53蛋白水平升高(3.8%±0.2%,ᇞᇞᇞP＜0.001)，Rb1可降低缺氧/复氧心肌细胞Drp1蛋白水平(2.5%±0.7%,ᇞP＜0.05)、p53蛋白水平(2.5%±0.2%,#P＜0.05)；与正常对照组(7.1%±3.1%)相比，缺氧/复氧诱导线粒体异常分裂(76.8%±6.4%,***P＜0.001)，Rb1处理后可降低线粒体分裂水平(37.8%±3.8%, ᇞᇞᇞP＜0.001)。

结论（1）缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡，Rb1降低ROS水平、抑制心肌细胞凋亡；（2）Rb1抑制凋亡的作用与调控线粒体融合与分裂有关，其分子机制可能与抑制p53蛋白水平的升高，从而影响Drp1蛋白水平升高而达到抑制线粒体异常分裂有关。

关键词：人参皂苷Rb1；缺氧/复氧；心肌细胞；线粒体融合与分裂；Drp1
Influences of Ginsenoside Rb1 on mitochondrial dynamics in NRCMs
hypoxia/reoxygenation model
Yi YANG a,b, Li-Ping MAI a, Xiao-Ying LIU a, Shao-Xian CHEN a, Xi-Yong YU a, Min YANG a,b＊
a Medical Research Center, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China;
b Department of Pharmacy, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China Objectives To investigate the influences of Ginsenoside Rb1 on mitochondrial fusion and fission in hypoxia/reoxygenation induced neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs). Methods AnearoPack System was used to induce H/R injury in NRCMs, cells were assigned randomly into control group, H/R-6h group, H/R-12h group, H/R-24h group, Rb1-50μM group, Rb1-200μM group; Apoptosis rate and ROS level were analyzed using flow cytometer; real time PCR was used to detect mRNAs level; protein level changes were measured by western-blotting; mitochondrial fusion and fission were determined by using a laser scanning confocal microscope. Results H/R induced apoptosis, Rb1 (50μM, 200μM) inhibited H/R induced apoptosis (41.0%±3.5%,***P ＜0.001 vs H/R group; 31.9%±1.5%,***P＜0.001 vs H/R group); H/R increased ROS levels (369.7±48.0,**P＜0.01 vs control), while Rb1 alleviated ROS levels (270.9± 9.9,*P＜0.05 vs H/R group); mRNA level of Drp1 was up-regulated after H/R (3.3± 0.5,▲▲▲P＜0.001 vs control), while mRNA levels of Fis1, Mfn1, Opa1 were not changed, and Rb1 down-regulated Drp1 mRNA level (2.4%±0.3%,▲P＜0.05 vs H/R group); Drp1 protein level was up-regulated (4.6%±0.2%,***P＜0.001 vs control), and was down-regulated by Rb1 treatment (2.5%±0.7%,ᇞP＜0.05 vs H/R group); p53 protein level was increased (3.8%±0.2%,ᇞᇞᇞP＜0.001 vs control), and was reduced
by Rb1 treatment (2.5%±0.2%,#P＜0.05 vs H/R group); H/R induced mitochondrial fission (76.8%±6.4%,***P＜0.001 vs control), which was relieved by Rb1 treatment (37.8%±3.8%,ᇞᇞᇞP＜0.001 vs H/R group). Conclusion (1) Hypoxia/reoxygenation induces apoptosis, Rb1 inhibits ROS up-regulation and apoptosis; (2) Rb1 inhibits mitochondrial fission, Drp1 and p53 protein expressions in H/R model in NRCMs.
Keywords Ginsenoside Rb1; Hypoxia/reoxygenation; NRCMs; Mitochondrial fusion and fission; Drp1
线粒体是一种高度动态变化的细胞器，在细胞中不断融合与分裂，形成紧密连接的线粒体网络[1]。

近些年的研究发现，线粒体融合与分裂参与了缺血/再灌注损伤、心衰、糖尿病性心肌病等，调控线粒体融合与分裂可能是药物治疗心肌缺血/再灌注损伤潜在的靶点[2]。

人参皂苷Rb1具有改善心肌缺血/再灌注损伤的作用[3]，其机制与AMPK和PI3K/Akt信号通路有关[4, 5]，但是抑制AMPK和PI3K/Akt并不能有效的阻断Rb1改善线粒体功能、抑制凋亡的作用，表明其他调控机制参与了Rb1抑制凋亡的作用，而有关Rb1对缺血/再灌注心肌线粒体融合与分裂影响的研究尚未见有报道，因此有必要对Rb1是否通过调控线粒体融合与分裂缓解心肌缺血/再灌注损伤以及有关分子机制进行探讨。

心肌细胞缺氧/复氧模型是体外模拟缺血/再灌注损伤合适的模型，本实验拟采用缺氧/复氧模型诱导线粒体分裂以及心肌细胞凋亡，通过给予Rb1，观察Rb1对线粒体融合与分裂影响并探讨有关分子机制。

1 材料与方法
1.1主要仪器与试剂
流式细胞仪（BECKMAN），荧光定量PCR仪（MJ Research, PTC-200），2.5L 密闭培养盒（Mitsubishi Gas Chemicals），激光共聚焦显微镜（Leica, SP5-FCS）；人参皂苷Rb1（上海同田生物），AnnexinV/PI试剂盒（Bender），DCFH-DA （Sigma），反转录试剂盒（TAKARA），实时定量PCR试剂盒（TAKARA），5%CO2安宁包（Mitsubishi Gas Chemical），MitoTracker® Red CMXRos（Molecular Probes）。

1.2实验分组
原代乳鼠心肌细胞随机分为正常对照组，缺氧/复氧6h组，缺氧/复氧12h组，缺氧/复氧24h，Rb1-50μM组（缺氧/复氧+Rb1-50μM），Rb1-200μM组（缺氧/复氧+Rb1-200μM）。

心肌细胞缺氧之后，复氧时即给予Rb1，缺氧结束后获取细胞并检测有关指标。

1.3缺氧/复氧模型建立
采用安宁包缺氧体系建立心肌细胞缺氧/复氧模型[6]。

将5%CO2安宁包放入置有细胞的密闭培养盒中，1h内可实现细胞缺氧；缺氧指定时间后，将培养基换成DMEM/F-12培养液，置于21% O2、5% CO2的37℃的细胞培养箱中进行复氧处理。

1.4流式细胞术检测凋亡
将获取的细胞转移EP管中，离心，PBS重悬，加入5ul AnnexinV标记后，每组细胞加入5ul PI，即可用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5流式细胞术检测ROS水平
将获取的细胞转移EP管中，离心，PBS重悬，加入2μl DCFH-DA储存液使最终浓度为10μM，即可用流式细胞仪检测细胞ROS水平。

1.6Real time PCR
Trizol裂解细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，获得的cDNA以20μl 体系，进入荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性40个循环（0.5min/循环），58℃退火0.5min，72℃延伸0.5。

每组3复孔，获得的数值取平均值，采用2-ᇞᇞCt法定量计算基因的表达。

1.7WB检测蛋白表达
提取细胞总蛋白，测蛋白浓度，各孔上样40μg蛋白，采用SDS-PAGE进行电泳，蛋白电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，孵育一抗与二抗后，曝光获得胶片，扫描胶片，获取的图片用image J软件进行灰度分析。

1.8激光共聚焦观察线粒体形态
使用MitoTracker Red（200nM）标记心肌细胞线粒体，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton-100通透，DAPI染细胞核后封片，制得的玻片即可采用激光共聚焦显微镜观察线粒体形态。

1.9统计学处理
采用SPSS13.0统计软件分析实验数据，并通过“x±s”表示；符合正态分布的多组间数据比较采用one-way ANOV A法进行分析；符合方差齐性的多组间比较采用LSD法；P＜0.05则认为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 人参皂苷Rb1抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡
采用AnnexinV/PI双标记-流式细胞术检测到，与缺氧/复氧组相比，Rb1（50μM, 200μM）可降低心肌细胞凋亡率（41.0%±3.5%,***P＜0.001;
31.9%±1.5%,***P＜0.001）。

表明Rb1可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。

图1. Rb1对缺氧/复氧心肌细胞凋亡率的影响。

采用AnnexinV/PI双标记-流式细胞术检测各实验组心肌细胞凋亡率（n=3）。

***P＜0.001（与缺氧/复氧组心肌细胞凋亡率相比）。

2.2人参皂苷Rb1降低缺氧/复氧心肌细胞ROS水平
采用DCFH-DA标记心肌细胞、流式细胞术检测到，与缺氧/复氧组相比，Rb1（200μM）可降低心肌细胞ROS水平（270.9±9.9,*P＜0.05）。

表明Rb1可降低缺氧/复氧心肌细胞ROS水平。

图2. Rb1对缺氧/复氧实验中ROS水平的影响。

采用DCFH-DA标记、流式细胞术检测各实验组ROS水平（n=3）。

*P＜0.05（与缺氧/复氧组心肌细胞活性氧水平相比），**P＜0.01（与正常对照组心肌细胞活性氧水平相比）
2.3 Drp1与p53参与缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡
采用实时定量PCR、Western blot检测缺氧/复氧对调控线粒体融合与分裂有关基因和蛋白表达的影响。

（a）与正常对照组相比，缺氧/复氧组Drp1 mRNA水平上升了约3倍（3.3±0.5,▲▲▲P＜0.001）；（b,c,d）与正常对照组相比，缺氧/复氧组Fis1、Mfn1、Opa1 mRNA表达差异没有统计学意义；（e）与正常对照组相比，缺氧/复氧组Drp1蛋白水平升高（***P＜0.001）；（f）与正常对照组相比，缺氧/复氧组p53蛋白水平升高（ᇞᇞᇞP＜0.001）。

表明Drp1与p53参与了缺氧/复氧诱导线粒体异常分裂。

图3. 缺氧/复氧对线粒体融合与分裂基因与蛋白的影响。

（a,b,c,d）通过Real time PCR检测线粒体融合与分裂有关基因（Drp1, Fis1, Mfn1, Opa1）的表达（n=4），▲▲▲P＜0.001（与正常对照组相比）；（e）采用Western blot 检测Drp1总蛋白水平（n=4），***P＜0.001（与正常对照组相比）；（f）采用Western blot 检测p53总蛋白水平（n=4），ᇞᇞᇞP＜0.001（与正常对照组相比）。

2.4 人参皂苷Rb1缓解缺氧/复氧诱导的线粒体分裂
采用实时定量PCR、Western blot检测以及激光共聚焦显微镜观察Rb1对缺氧/复氧心肌细胞线粒体融合与分裂的影响。

（a）与缺氧/复氧组相比，给予Rb1后下降Drp1 mRNA水平（2.4±0.4, *P＜0.05），而Rb1对Fis1、Mfn1、Opa1 mRNA 表达没有影响；（b,c）与缺氧/复氧相比，Rb1可降低缺氧/复氧心肌细胞Drp1蛋白水平（2.5%±0.7%,ᇞP＜0.05）、p53蛋白水平（2.5%±0.2%,#P＜0.05）；（e）与正常对照组相比（7.1%±3.1%），缺氧/复氧（76.8%±6.4%）诱导线粒体异常分裂（***P＜0.001），Rb1处理后可降低线粒体异常分裂水平（37.8%±3.8%,ᇞᇞᇞP＜0.001）。

表明Rb1可缓解缺氧/复氧诱导的心肌细胞线粒体异常分裂，其机制与下调Drp1 mRNA水平、Drp1蛋白水平以及p53蛋白水平有关。

图4. Rb1对线粒体融合与分裂的影响。

（a）通过Real time PCR检测线粒体融合与分裂有关基因（Drp1, Fis1, Mfn1, Opa1）的表达（n=4），▲▲▲P＜0.001（与正常对照组相比），▲P＜0.05（与缺氧/复氧组相比）；（b）采用Western blot 检测Drp1总蛋白水平（n=4），ᇞP＜0.05（与缺氧/复氧组相比）；（c）采用Western blot 检测p53总蛋白水平（n=4），#P＜0.05（与缺氧/复氧组相比）；（d）各实验组代表性线粒体形态图；（e）采用激光共聚焦显微镜观察线
粒体
形态，并随机采集不同视野下至少300个细胞，进行定量分析线粒体融合与分裂（n=4）。

***P＜0.001（与正常对照组相比），ᇞᇞᇞP＜0.001（与缺氧/复氧组相比）。

3讨论
缺血/再灌注损伤是人类致死的主要原因，目前缺血/再灌注损伤的研究关注该病理条件下的分子机制以及寻找新的治疗方式。

通过调控线粒体融合与分裂，尤其是抑制病理状况下的线粒体异常分裂可能成为治疗缺血/再灌注损伤的新手段。

Rb1具有改善心肌缺血/再灌注损伤的作用，而有关Rb1对缺血/再灌注心肌线粒体融合与分裂影响的研究尚未见有报道，因此本文对Rb1对缺氧/复氧心肌细胞线粒体融合与分裂的影响进行探讨。

心肌缺血时，线粒体分裂主要与线粒体分裂蛋白Drp1的翻译后修饰有关，此时Drp1丝氨酸637位点去磷酸化，去磷酸化的Drp1由胞浆招募至线粒体外膜，从而诱导线粒体分裂[7, 8]。

Drp1去磷酸化的修饰与Calcinuerin以及Siah2的
激活有关[9]，而激活PKA会产生相反的作用，即促进Drp1的磷酸化。

而关于心
肌缺血时，Drp1总蛋白的表达是否变化，文献报道并不一致。

有研究发现，缺氧心肌细胞Drp1不仅发去生磷酸化，同时总蛋白水平也升高[10]；而另有文献发现，缺氧心肌细胞主要是由于Drp1去磷酸化引起的，而Drp1总蛋白水平并没有发生变化[9]。

本实验中采用人参皂苷Rb1在缺氧前干预，并没有检测到Rb1的心肌细胞保护作用（这里未给出数据），在复氧前给予Rb1可检测到其良好的心肌细胞保护作用。

因此，我们认为人参皂苷Rb1的心肌保护作用与Drp1的蛋白翻译后修饰以及上游的Calcineurin以及Siah2的信号转导途径可能没有影响，而是在复氧时发挥作用。

心肌缺血/再灌注时，心肌细胞线粒体持续异常分裂，这与可能与再灌注是引起的氧化应激有关。

在其他的氧化应激模型中也得到了相似的结果，HF-LPLI 氧化应激模型诱导COS-7细胞ROS水平升高、Drp1转移至线粒体并诱导线粒体异常分裂[11]；另有研究采用双氧水处理心肌细胞，心肌细胞发生氧化应激后，p53转录调控Drp1总蛋白水平以及 mRNA表达升高并诱导线粒体异常分裂，但是并没指出双氧水诱导的心肌细胞氧化应激是否促进Drp1转移至线粒体[12]。

我们的实验发现，缺氧/复氧诱导心肌细胞ROS水平升高、心肌细胞凋亡，复氧的时候给予Rb1干预具有心肌保护作用。

缺氧/复氧诱导p53与Drp1总蛋白水平升高，人参皂苷Rb1可降低缺氧/复氧心肌细胞的p53与Drp1总蛋白水平。

因此我们得到如下结论，Rb1对缺氧/复氧心肌细胞线粒体融合与分裂的影响与抑制缺氧/复氧心肌细胞Drp1 mRNA的表达以及Drp1总蛋白的表达有关。

有文献报道p53可转录激活线粒体分裂蛋白Drp1,在本实验中检测到p53蛋白水平的升高，Rb1可抑制p53蛋白水平的升高。

因此，Rb1可能通过抑制p53-Drp1-线粒体融合分裂信号通路缓解心肌缺血/再灌注损伤。

尽管如此，该研究还尚浅，Rb1抑制心肌细胞凋亡的作用是否通过抑制该信号通路，还需要进行更深入的研究，比如采用siRNA或工具药对有关蛋白进行干预以及在体内实验上进一步的探讨。

References:
[1]. Westermann, B., Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010. 11(12): p. 872-84.
[2]. 杨轶与杨敏, 线粒体融合与分裂：治疗缺血性心脏疾病的潜在靶点. 今日药学, 2012. 22(12): 第757-762页.
[3]. Lu, J.M., Q. Yao and C. Chen, Ginseng compounds: an update on their molecular mechanisms and medical applications. Curr Vasc Pharmacol, 2009. 7(3): p. 293-302.
[4]. Wang, Z., et al., Ginsenoside Rb1 preconditioning protects against myocardial infarction after regional ischemia and reperfusion by activation of phosphatidylinositol-3-kinase signal transduction. Cardiovasc Drugs Ther, 2008. 22(6): p. 443-52.
[5]. Kong, H.L., et al., Ginsenoside Rb1 protects cardiomyocytes against CoCl2-induced apoptosis in neonatal rats by inhibiting mitochondria permeability transition pore opening. Acta Pharmacol Sin, 2010. 31(6): p. 687-95.
[6]. 杨轶,杨敏等, 安宁包缺氧体系用于构建乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的研究. 岭南心血管病杂志, 2013.19(4): 第498-34页.
[7]. Cribbs, J.T. and S. Strack, Reversible phosphorylation of Drp1 by cyclic AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death. EMBO Rep, 2007. 8(10): p. 939-44.
[8]. Chang, C.R. and C. Blackstone, Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylation of Drp1 regulates its GTPase activity and mitochondrial morphology. J Biol Chem, 2007. 282(30): p. 21583-7.
[9]. Kim, H., et al., Fine-tuning of Drp1/Fis1 availability by AKAP121/Siah2 regulates mitochondrial adaptation to hypoxia. Mol Cell, 2011. 44(4): p. 532-44.
[10]. Wang, J.X., et al., miR-499 regulates mitochondrial dynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1. Nat Med, 2011. 17(1): p. 71-8.
[11]. Wu, S., et al., Mitochondrial oxidative stress causes mitochondrial fragmentation via differential modulation of mitochondrial fission-fusion proteins. FEBS J, 2011. 278(6): p. 941-54.
[12]. Li, J., et al., miR-30 regulates mitochondrial fission through targeting p53 and the dynamin-related protein-1 pathway. PLoS Genet, 2010. 6(1): p. e1000795.。