3种鲳属鱼类线粒体COI基因序列变异及系统进化
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摘要：对采自东海的银鲳 （Pampus argenteus）、翎鲳 （P. punctatissimus） 和中国鲳 （P. chinensis）3 种鲳属鱼类的线粒体 COI 基因序列片段进行扩增和序列测定，得到 603 bp 的基因片段，编码 201 个氨基酸，碱基 T、C、A、G 平均含量分别为 34.2%、22.3%、25.9% 和 17.6 %。所得序列共定义 12 个单倍型，中国鲳只有 1 个单倍型，银鲳 3 个单倍型，翎鲳 8 个单倍型， 在这 12 个单倍型中共检测到 109 个变异位点。3 种鲳密码子的使用均存在明显的偏向性，且同义密码子使用偏向性高 度一致。银鲳和中国鲳的遗传距离最大 （0.165~0.168），与翎鲳的遗传距离次之 （0.151~0.162），翎鲳和中国鲳的遗传距 离最小 （0.058~0.065）。由进化树可知，翎鲳和中国鲳的进化关系最近，它们与银鲳的进化关系较远，银鲳是最早形成的 种。分子水平自然选择的检验结果表明，自然选择在银鲳和翎鲳线粒体 COI 基因差异形成过程中起一定的作用。本研 究从分子水平研究中国东海海域鲳属鱼类的分类、遗传关系和系统进化，以其了解鲳属鱼类以及与鲳科之间的亲缘关 系，又为鲳属鱼类保护生物学和系统进化提供分子生物学依据。［ 中国水产科学，2008，15（3）：392－399］
用 Mega3.0［18］ 对 所 测 序 列 进 行 对 位 排 列，并 结合人工核查，利用“Statistics”程序对所得序列的 碱基组成、核苷酸位点替换数和密码子使用频率进 行统计，计算个体之间遗传距离。在系统进化树构 建之前，采用 Modeltest 软件 ［19］ 确定序列最适合的 进 化 模 式。 采 用 NJ 法 （Neighbor-Joining method） 和 ML 法 （Maximum Likelihood method） 两 种 建 树 方 法 对 序 列 进 行 分 析。NJ 法 利 用 PAUP * 4.0 软件包 ［20］，经启发式搜索 （Heuristic search），重建 系 统 发 生 树，Bootstrap 置 信 值 ［21］ 估 算 重 复 次 数 1 000 次；ML 法 采 用 TREEFINDER 软 件 ［22］ 进 行 分析，Bootstrap 分析 ［21］ 重复 100 次，两种方法均
银鲳的 3 个单倍型编码的氨基酸序列存在 1 个变异位点，翎鲳的 8 个单倍型有 4 个氨基酸变 异位点。本研究结果测定的序列中，UUC（ 苯丙氨 酸，F） 和 AUU（ 异亮氨酸，I） 的平均使用频率最 高，均达到 10.0 次以上，CGC（ 精氨酸，R） 只出现 1.0 次，还有几种密码子没有被使用，其他使用次数 一般在 3~7 次之间。3 种鱼类同义密码子使用偏 向性高度一致，比如在中国鲳 / 翎鲳 / 银鲳序列中 UUC（F）、AUU（I）、GUA（V） 的平均使用次数分别 是 13.0/12.6/15.0、14.0/15.2/14.0、10.0/10.4/9.0。
第3期
张凤英等：3 种鲳属鱼类线粒体 COI 基因序列变异及系统进化
393
相关序列进行比较研究，以期了解鲳属鱼类以及与 鲳科之间的亲缘关系，为鲳属鱼类保护生物学和系 统进化提供分子生物学依据。
1 材料ห้องสมุดไป่ตู้方法
1.1 材料 实验用银鲳、翎鲳和中国鲳采自浙江舟山群岛
海域，另有部分翎鲳样品采自东海近海和远海，冰 鲜运回实验室后 －75 ℃冰箱保存备用。 1.2 总DNA的提取
通过获得的 12 个单倍型与 GenBank 中序列 进行 Blast 比较，核苷酸序列与已知的翎鲳 COI 序 列相似性为 86.2%~100%，其中，所测翎鲳的 1 条序 列和已提交序列完全相同。比较这 3 种鲳属鱼类 COI 序列显示，在 603 个核苷酸位点中，没有插入、 缺失及终止密码子出现，共有 109 个变异位点，85 个简约信息位点。在获得的银鲳 3 个单倍型存在 5 个变异位点，8 个翎鲳单倍型存在 11 个变异位点。 在碱基组成上，T、C、A、G 平均含量分别为 34.2%、 22.3%、25.9% 和 17.6 %，A+T 含量较高，为 60.1%。 2.2 密码子使用偏向性
采用 Modeltest 获得的参数构建系统进化树。分子 水平自然选择作用的检测采用 Ka/Ks （Nei-Gojobori method） 检验 ［23］ 和 MK 检验 （McDonald-Kreitman test）［24］。
2 结果与分析
研究中用于测定线粒体 COI 序列的银鲳和中 国鲳各 5 个，翎鲳 14 个样本，分别得到单倍型数为 3 个、1 个和 8 个。所得序列长 603 bp，编码 201 个 氨基酸。基因序列已提交到 GenBank，登录号为 EU119289~119300。 2.1 mtDNA COI基因片段序列分析
2.3 遗传距离 由 表 1 可 以 看 出，3 个 银 鲳 单 倍 型 遗 传 距 离
收稿日期：2007－07－24；修订日期：2007－11－16. 基金项目：国家科技基础条件平台建设子项目课题 （2006DKA30470_004）；上海市科技兴农重点攻关项目 ［ 沪农科攻字 （2004） 第 8-3 号 ］；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 （2007M22）. 作者简介：张凤英 （1976－），女，助理研究员，硕士，主要从事水产动物遗传学研究 . E-mail：zhangfy76@ 通讯作者：马凌波 . Tel：021-65688139；E-mail：malingbo@
603 bp 的核苷酸序列共编码 201 个氨基酸，其 中有 12 个发生了变异。在 12 个单倍型中，所有的 转换和颠换比值是 4.0。第 1 密码子只存在 4 个转 换位点，第 2 密码子只有 1 个颠换位点，而第 3 密 码子的变异位点很多，存在 22 个转换位点和 5 个 颠换位点。
密码子中，A、T、G、C 在 1、2、3 位点的平均含 量差别很大，其中 G 的平均含量变化最大，第 1、2、 3 位点 G 的平均含量分别是 31.3%、15.4% 和 6.1%， 这表明密码子的碱基使用频率存在明显的偏向性。
银鲳翎鲳和中国鲳鉴定结果未显示其中翎鲳数量最多未发现灰鲳和珍鲳样品同时对其线粒体coi基因的研究结果也证实只有这3396中国水产科学第15为进一步验证东海广泛分布的究竟是何种鲳属鱼类笔者在东海近海和外海又采集到大量鲳鱼经形态和分子生物学鉴定也是翎鲳未发现灰鲳这说明翎鲳可能广泛分布于东海一些文献中提到的东海灰鲳实际上很可能就是分类学上的翎鲳n
第15卷第3期 2008年5月
中国水产科学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol.15 No.3 May 2008
3 种鲳属鱼类线粒体 COI 基因序列变异及系统进化
张凤英 1，2，马凌波 1，施兆鸿 1，马春艳 1
（1. 中国水产科学研究院 东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业重点开放实验室，上海 200090；2. 华东师范大学 生命科学 学院，上海 200063 ）
关键词：鲳属；线粒体 COI 基因；序列变异；系统进化；自然选择 中图分类号：Q959.483 文献标识码：A 文章编号：1005－8737－（2008）03－0392－08
鲳属 （Pampus） 鱼类属于硬骨鱼纲 （Osteichthyes）， 鲈 形 目 （Perciformes），鲳 亚 目 （Stromateoidei）， 鲳 科 （Stromateidae），具 有 很 高 的 营 养 价 值 和 经 济价值，是东海区重要经济鱼类之一。近 20 年来， 虽然东海区鲳的年海洋捕捞产量呈连续上升趋 势，但其平均体质量、优势叉长组成及年龄组成均 出现明显下降趋势，资源状况不容乐观 ［1］。自从 Gill［2］ 把 鲳 属 分 为 2 个 亚 属 以 来，鲳 属 鱼 类 的 分 类问题一直成为分类学家争论的焦点 ［3－9］，尤其 在 银 鲳 （Pampus argenteus）、灰 鲳 （P. cinereus） 和翎鲳 （P. punctatissimus） 的命名上存在很大争 议，Haedrich［3］ 认为灰鲳是银鲳的同物异名，伍汉 霖 ［5］ 把翎鲳视为银鲳，成庆泰 ［6－7］ 将翎鲳视为灰 鲳。Liu 等 ［8－9］ 对翎鲳做了重新描述，认为翎鲳是 区 别 于 银 鲳 的 有 效 种，它 和 灰 鲳 在 形 态 上 非 常 相 似，是 一 对 姐 妹 种。 故 有 很 多 文 献 把 翎 鲳 误 认 为 是灰鲳。
取约 200 mg 尾部肌肉放入 1.5 mL 的离心管 中，加入 500 L 的 TE 缓冲液，剪碎，再加入终质量 分 数 为 0.5% 的 SDS 和 200 g•mL－1 的 蛋 白 酶 K， 于 55 ℃消化 2~3 h，消化物经酚 / 氯仿、氯仿抽提， 2 倍体积无水乙醇沉淀，70% 无水乙醇洗涤，室温干 燥后溶于 ddH2O 中，4 ℃冰箱保存备用。 1.3 PCR扩增和测序
394
中国水产科学
第15卷
图 1 银鲳、翎鲳、中国鲳线粒体 COI 基因序列变异位点 注：图中数字表示碱基位点数；Pa－ 银鲳，Pc－ 中国鲳，Pp－ 翎鲳 . Fig.1 Variable sites of mitochondrial COI gene segments in Pampus argenteus，P. punctatissimus and P. chinensis Note：The numbers in the figure denote base sites. Pa－P. argenteus，Pc－P. chinensis，Pp－P. punctatissimus.
随着分子生物学的发展，基于基因序列测定的 分子数据已被广泛应用在鱼类分类学、系统学和种
群遗传学方面，分子数据与传统形态学分类方法相 结合使得原来难以界定的物种分类得到较好的解 决 。 ［10－11］ 以往学者们已从鳃耙、幽门盲囊、耳石、 侧线管、头颅、脊椎骨等形态特征的比较分析对鲳 属鱼类分类进行了较为系统的研究 ［12］，但未见有 从分子生物学角度对其研究的报道。DNA 分子作 为遗传信息的载体，是进化历史的忠实记录者。线 粒 体 DNA（mitochondrial DNA，简 称 mtDNA） 结 构简单，呈母性遗传，进化速度快且不发生重组，是 一种应用较广的分子标记，其中一些基因已经被广 泛用于系统进化研究 。 ［13-16］ 细胞色素氧化酶 I 亚 基 （cytochrome oxidase subunit I，COI） 基因具有进 化速率适中的特点，可作为种属系统进化研究的良 好标记 。 ［15－16］ 本研究对分布于东海海域的银鲳、 翎鲳和中国鲳 （P. chinensis）mtDNA COI 基因序列 片段进行了扩增和测序，初步分析了它们之间的系 统进化关系，并从 GenBank 中下载了鲳科的中间 低鳍鲳 （Peprilus medius） 和星斑真鲳 （Stromateus stellatus） 以及长鲳科的刺鲳 （Psenopsis anomala）
采 用 通 用 引 物 扩 增 COI 基 因，引 物 为 COIa： A G TATA A G C G T C T G G G TA G T C 和 C O I f ： CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC［17］，由上海生工生 物工程有限公司合成。PCR 反应在 PTC-200 PCR 仪 上 进 行，反 应 总 体 积 是 50 L，反 应 体 系 为：10 ×buffer 5.0 L，Mg2+ 终 浓 度 为 2.0 mmol/L，引 物 （10 mol/L） 为 2 L，dNTP（ 各 2.5 mmol • L－1）4 L， Taq 酶 （TaKaRa，5 U • L－1）0.4 L，模 板 2.0 L，用 ddH2O 补足体积。反应程序为：94 ℃预变性 5 min， 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，35 个循环。最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1.5% 含 EB 的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统 观察并照相。 1.4 数据分析
用 Mega3.0［18］ 对 所 测 序 列 进 行 对 位 排 列，并 结合人工核查，利用“Statistics”程序对所得序列的 碱基组成、核苷酸位点替换数和密码子使用频率进 行统计，计算个体之间遗传距离。在系统进化树构 建之前，采用 Modeltest 软件 ［19］ 确定序列最适合的 进 化 模 式。 采 用 NJ 法 （Neighbor-Joining method） 和 ML 法 （Maximum Likelihood method） 两 种 建 树 方 法 对 序 列 进 行 分 析。NJ 法 利 用 PAUP * 4.0 软件包 ［20］，经启发式搜索 （Heuristic search），重建 系 统 发 生 树，Bootstrap 置 信 值 ［21］ 估 算 重 复 次 数 1 000 次；ML 法 采 用 TREEFINDER 软 件 ［22］ 进 行 分析，Bootstrap 分析 ［21］ 重复 100 次，两种方法均
银鲳的 3 个单倍型编码的氨基酸序列存在 1 个变异位点，翎鲳的 8 个单倍型有 4 个氨基酸变 异位点。本研究结果测定的序列中，UUC（ 苯丙氨 酸，F） 和 AUU（ 异亮氨酸，I） 的平均使用频率最 高，均达到 10.0 次以上，CGC（ 精氨酸，R） 只出现 1.0 次，还有几种密码子没有被使用，其他使用次数 一般在 3~7 次之间。3 种鱼类同义密码子使用偏 向性高度一致，比如在中国鲳 / 翎鲳 / 银鲳序列中 UUC（F）、AUU（I）、GUA（V） 的平均使用次数分别 是 13.0/12.6/15.0、14.0/15.2/14.0、10.0/10.4/9.0。
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张凤英等：3 种鲳属鱼类线粒体 COI 基因序列变异及系统进化
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相关序列进行比较研究，以期了解鲳属鱼类以及与 鲳科之间的亲缘关系，为鲳属鱼类保护生物学和系 统进化提供分子生物学依据。
1 材料ห้องสมุดไป่ตู้方法
1.1 材料 实验用银鲳、翎鲳和中国鲳采自浙江舟山群岛
海域，另有部分翎鲳样品采自东海近海和远海，冰 鲜运回实验室后 －75 ℃冰箱保存备用。 1.2 总DNA的提取
通过获得的 12 个单倍型与 GenBank 中序列 进行 Blast 比较，核苷酸序列与已知的翎鲳 COI 序 列相似性为 86.2%~100%，其中，所测翎鲳的 1 条序 列和已提交序列完全相同。比较这 3 种鲳属鱼类 COI 序列显示，在 603 个核苷酸位点中，没有插入、 缺失及终止密码子出现，共有 109 个变异位点，85 个简约信息位点。在获得的银鲳 3 个单倍型存在 5 个变异位点，8 个翎鲳单倍型存在 11 个变异位点。 在碱基组成上，T、C、A、G 平均含量分别为 34.2%、 22.3%、25.9% 和 17.6 %，A+T 含量较高，为 60.1%。 2.2 密码子使用偏向性
采用 Modeltest 获得的参数构建系统进化树。分子 水平自然选择作用的检测采用 Ka/Ks （Nei-Gojobori method） 检验 ［23］ 和 MK 检验 （McDonald-Kreitman test）［24］。
2 结果与分析
研究中用于测定线粒体 COI 序列的银鲳和中 国鲳各 5 个，翎鲳 14 个样本，分别得到单倍型数为 3 个、1 个和 8 个。所得序列长 603 bp，编码 201 个 氨基酸。基因序列已提交到 GenBank，登录号为 EU119289~119300。 2.1 mtDNA COI基因片段序列分析
2.3 遗传距离 由 表 1 可 以 看 出，3 个 银 鲳 单 倍 型 遗 传 距 离
收稿日期：2007－07－24；修订日期：2007－11－16. 基金项目：国家科技基础条件平台建设子项目课题 （2006DKA30470_004）；上海市科技兴农重点攻关项目 ［ 沪农科攻字 （2004） 第 8-3 号 ］；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 （2007M22）. 作者简介：张凤英 （1976－），女，助理研究员，硕士，主要从事水产动物遗传学研究 . E-mail：zhangfy76@ 通讯作者：马凌波 . Tel：021-65688139；E-mail：malingbo@
603 bp 的核苷酸序列共编码 201 个氨基酸，其 中有 12 个发生了变异。在 12 个单倍型中，所有的 转换和颠换比值是 4.0。第 1 密码子只存在 4 个转 换位点，第 2 密码子只有 1 个颠换位点，而第 3 密 码子的变异位点很多，存在 22 个转换位点和 5 个 颠换位点。
密码子中，A、T、G、C 在 1、2、3 位点的平均含 量差别很大，其中 G 的平均含量变化最大，第 1、2、 3 位点 G 的平均含量分别是 31.3%、15.4% 和 6.1%， 这表明密码子的碱基使用频率存在明显的偏向性。
银鲳翎鲳和中国鲳鉴定结果未显示其中翎鲳数量最多未发现灰鲳和珍鲳样品同时对其线粒体coi基因的研究结果也证实只有这3396中国水产科学第15为进一步验证东海广泛分布的究竟是何种鲳属鱼类笔者在东海近海和外海又采集到大量鲳鱼经形态和分子生物学鉴定也是翎鲳未发现灰鲳这说明翎鲳可能广泛分布于东海一些文献中提到的东海灰鲳实际上很可能就是分类学上的翎鲳n
第15卷第3期 2008年5月
中国水产科学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol.15 No.3 May 2008
3 种鲳属鱼类线粒体 COI 基因序列变异及系统进化
张凤英 1，2，马凌波 1，施兆鸿 1，马春艳 1
（1. 中国水产科学研究院 东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业重点开放实验室，上海 200090；2. 华东师范大学 生命科学 学院，上海 200063 ）
关键词：鲳属；线粒体 COI 基因；序列变异；系统进化；自然选择 中图分类号：Q959.483 文献标识码：A 文章编号：1005－8737－（2008）03－0392－08
鲳属 （Pampus） 鱼类属于硬骨鱼纲 （Osteichthyes）， 鲈 形 目 （Perciformes），鲳 亚 目 （Stromateoidei）， 鲳 科 （Stromateidae），具 有 很 高 的 营 养 价 值 和 经 济价值，是东海区重要经济鱼类之一。近 20 年来， 虽然东海区鲳的年海洋捕捞产量呈连续上升趋 势，但其平均体质量、优势叉长组成及年龄组成均 出现明显下降趋势，资源状况不容乐观 ［1］。自从 Gill［2］ 把 鲳 属 分 为 2 个 亚 属 以 来，鲳 属 鱼 类 的 分 类问题一直成为分类学家争论的焦点 ［3－9］，尤其 在 银 鲳 （Pampus argenteus）、灰 鲳 （P. cinereus） 和翎鲳 （P. punctatissimus） 的命名上存在很大争 议，Haedrich［3］ 认为灰鲳是银鲳的同物异名，伍汉 霖 ［5］ 把翎鲳视为银鲳，成庆泰 ［6－7］ 将翎鲳视为灰 鲳。Liu 等 ［8－9］ 对翎鲳做了重新描述，认为翎鲳是 区 别 于 银 鲳 的 有 效 种，它 和 灰 鲳 在 形 态 上 非 常 相 似，是 一 对 姐 妹 种。 故 有 很 多 文 献 把 翎 鲳 误 认 为 是灰鲳。
取约 200 mg 尾部肌肉放入 1.5 mL 的离心管 中，加入 500 L 的 TE 缓冲液，剪碎，再加入终质量 分 数 为 0.5% 的 SDS 和 200 g•mL－1 的 蛋 白 酶 K， 于 55 ℃消化 2~3 h，消化物经酚 / 氯仿、氯仿抽提， 2 倍体积无水乙醇沉淀，70% 无水乙醇洗涤，室温干 燥后溶于 ddH2O 中，4 ℃冰箱保存备用。 1.3 PCR扩增和测序
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中国水产科学
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图 1 银鲳、翎鲳、中国鲳线粒体 COI 基因序列变异位点 注：图中数字表示碱基位点数；Pa－ 银鲳，Pc－ 中国鲳，Pp－ 翎鲳 . Fig.1 Variable sites of mitochondrial COI gene segments in Pampus argenteus，P. punctatissimus and P. chinensis Note：The numbers in the figure denote base sites. Pa－P. argenteus，Pc－P. chinensis，Pp－P. punctatissimus.
随着分子生物学的发展，基于基因序列测定的 分子数据已被广泛应用在鱼类分类学、系统学和种
群遗传学方面，分子数据与传统形态学分类方法相 结合使得原来难以界定的物种分类得到较好的解 决 。 ［10－11］ 以往学者们已从鳃耙、幽门盲囊、耳石、 侧线管、头颅、脊椎骨等形态特征的比较分析对鲳 属鱼类分类进行了较为系统的研究 ［12］，但未见有 从分子生物学角度对其研究的报道。DNA 分子作 为遗传信息的载体，是进化历史的忠实记录者。线 粒 体 DNA（mitochondrial DNA，简 称 mtDNA） 结 构简单，呈母性遗传，进化速度快且不发生重组，是 一种应用较广的分子标记，其中一些基因已经被广 泛用于系统进化研究 。 ［13-16］ 细胞色素氧化酶 I 亚 基 （cytochrome oxidase subunit I，COI） 基因具有进 化速率适中的特点，可作为种属系统进化研究的良 好标记 。 ［15－16］ 本研究对分布于东海海域的银鲳、 翎鲳和中国鲳 （P. chinensis）mtDNA COI 基因序列 片段进行了扩增和测序，初步分析了它们之间的系 统进化关系，并从 GenBank 中下载了鲳科的中间 低鳍鲳 （Peprilus medius） 和星斑真鲳 （Stromateus stellatus） 以及长鲳科的刺鲳 （Psenopsis anomala）
采 用 通 用 引 物 扩 增 COI 基 因，引 物 为 COIa： A G TATA A G C G T C T G G G TA G T C 和 C O I f ： CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC［17］，由上海生工生 物工程有限公司合成。PCR 反应在 PTC-200 PCR 仪 上 进 行，反 应 总 体 积 是 50 L，反 应 体 系 为：10 ×buffer 5.0 L，Mg2+ 终 浓 度 为 2.0 mmol/L，引 物 （10 mol/L） 为 2 L，dNTP（ 各 2.5 mmol • L－1）4 L， Taq 酶 （TaKaRa，5 U • L－1）0.4 L，模 板 2.0 L，用 ddH2O 补足体积。反应程序为：94 ℃预变性 5 min， 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，35 个循环。最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1.5% 含 EB 的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统 观察并照相。 1.4 数据分析