益生菌对特应性湿疹的控制作用

Probiotics in the management of atopic eczema
益生菌对特应性湿疹的控制作用
作者：Isolauri1, T. Arvola2, Y. Sütas1, E. Moilane n3, S.Salmine n4
1图尔库大学儿科教研室，2坦佩雷大学医院儿科部，3坦佩雷大学医学院药理教研室/坦佩雷大学医院临床化学科，4生物化学与食品化学教研室，图尔库大学，芬兰
文章出处：《临床与实验变态反应杂志》，V ol.30, 1604—1610
摘要
背景：近20年来，工业国家的过敏性疾病发病率显著增加，因此迫切需要研制开发新的治疗方法。

目的：经随机双盲安慰剂对照试验证实，益生素在早期炎症反应有潜在的控制作用。

方法：27名平均年龄4.6个月的婴儿（母乳喂养，未曾接触过其他婴儿或其他配方奶粉）确诊患有特应性湿疹。

患儿停止母乳喂养后分组，分别服用含益生菌双歧杆菌（Bb-12）或乳酸杆菌L GG （A TCC 53103）或不含益生菌的完全水解乳清配方奶粉。

本实验分别检测了炎症范围和程度，婴儿生长和营养情况，循环细胞因子/趋化因子浓度，血清中可溶性细胞表面粘附分子，甲基组胺和尿嗜酸粒细胞蛋白-X。

结果：特应性皮炎评分标准（SCORAD评分）可显示特应性湿疹的范围和严重程度，母乳喂养期，SCORAD指数为16（7-15），中位数（四分位差）。

同服用未添加益生菌配方奶的患儿相比，两个月后，服用添加益生菌配方奶的患儿有明显好转；x2=12.27. P=0.002. 添加双歧杆菌Bb-12组的患儿SCORAD评分降至0（0-3.8），乳酸杆菌组的SCORAD降至1（0.1-8.7），与未添加组评分形成对比——13.4（4.5-18.2），中位数（四分位差）。

同时检测发现可溶性CD4的血清浓度和尿嗜酸性粒细胞蛋白X均降低。

结论：本实验首次证明特异益生菌种对过敏炎症反应的帮助。

数据进一步说明益生菌可能抵抗炎症反应的肠道环境。

当宿主体内新产生的抗体敏感性不强时，这些益生菌株联合作用，可帮助婴儿度过断奶期。

因此益生菌为过敏治疗和预防提供了食物治疗的新方向。

关键词：过敏性炎症反应，特应性，母乳喂养，食物过敏，婴儿，益生菌
临床与实验变态反应杂志，Vol.30,pp.1604—1610。

投稿时间：2000年1月26日；修改时间2000年4月13日；定稿日期：2000年4月27日
前言
益生菌是对身体有益的食物活性成分1，健康人体消化道正常的微生物群落，其中最常见的菌群是乳酸杆菌和双歧杆菌。

目前益生菌还是腹泻的最佳治疗方法2，3，其消化道屏障作用
在临床有显著效果：降低小肠渗透性4、调节小肠菌落平衡5，从而提高小肠IgA反应6。

本实验所用的菌株双歧杆菌Bb-12和乳酸杆菌LGG（A TCC53103）婴儿均可安全服用2，3。

近年来流行病学和实验研究发现了炎症与特应性的逆相关性以及它们与T辅助细胞表型存在交叉调节关系7，8。

控制炎症反应（一种对特应性疾病的过度敏感）还能在菌群与过敏性宿主之间产生良性反应9，10。

微生物抗原可与肠道固有菌群产生反应，正常菌群作用于粘膜表面对宿主免疫系统产生深远影响11：早期持续的微生物刺激所产生的影响远超过偶发炎症。

体外实验证实，特殊菌种对食物抗原引起的炎症反应有调节潜能，并能平衡促炎症反应、抗炎细胞因子的产生12-14。

胃肠道微生物群，作为一种内源防御机制，有助于探索影响炎症反应方法，尤其在断奶后新生抗原首次产生时。

因此，为了评价文献中阐述的益生菌是否具有免疫调节的临床作用，本实验通过随机双盲安慰剂对照试验评估了益生菌在特应性湿疹患儿中的作用。

特应性湿疹是常见的过敏首发症状。

方法
实验对象
我们从100名早期特应性湿疹患儿中选出27名，确诊使用Hanifin儿童特异性皮炎诊断标准15。

其他选择标准包括患儿在母乳喂养时发生特应性湿疹，患儿未曾接触过其他婴儿，入选前未食用其他配方奶粉，对本配方奶耐受。

试验患儿中，平均1.6（1.3-2.0）月大时发生特应性湿疹，（95% 置信区间CI）。

15名患儿（56%）出现胃肠道症状包括呕吐、溏便、腹泻。

多数患儿（82%）一级家庭成员有特应性湿疹病史。

患儿平均年龄4.6个月大，完全母乳喂养，参加实验后断奶。

参加实验时，血清总IgE浓度（phadebas IgE Prist，法玛西亚公司，瑞典）为7（IQR-20）kU/L。

患儿经放射变应原吸附试验（法玛西亚公司）测定鸡蛋、牛奶、小麦反应阳性，分别为16%、11%、4%，皮肤点刺试验测定鸡蛋、牛奶、小麦反应阳性，分别为15%、8%、15%。

所有患儿家庭签署书面知情同意书，同意参加实验。

本实验得到Tampere大学附属医院伦理委员会批准。

实验设计
本实验为随机双盲试验，患儿平均分成三组：其中两组断奶，分别服用含益生菌（一组为双歧杆菌Bb-12，一组为乳酸杆菌LGG）的彻底水解乳清婴儿配方奶粉（Peptidi-Tutteli，Valio 有限公司，芬兰），一组断奶，服用不含益生菌的彻底水解乳清婴儿配方奶粉。

根据相关文
献记载双歧杆菌Bb-12（Christian Hansen A/S，赫斯霍尔姆，丹麦）和乳酸杆菌LGG（Valio 有限公司，赫尔辛基，芬兰）安全并能有效治疗新生儿急性腹泻，故本实验选用这两种益生菌。

从以前临床研究2，3和居民腹泻研究，和腹泻病人研究5，17可知益生菌的浓度范围是3×10x（LGG）—1×109（Bb-12）集落形成单位(cfu)/g。

一名微生物学家通过标准平板计数法独立控制复方奶粉总各种微生物的含量。

主要测量数据
初级结果测量包括特应性湿疹的范围、程度和主观症状（包括瘙痒、失眠）。

刺激结果测量包括血清中可溶性细胞分子浓度、细胞因子/趋化因子浓度和尿液中甲基组胺浓度和嗜酸粒细胞蛋白-X（EPX）浓度。

在所有测量单位中，粒巨嗜系集落刺激因子（GM-CSF），可溶性细胞间粘附分子1（slCAM-1），肿瘤坏死因子-α（TNFα）以测量炎症状态；可溶性CD4（sCD4）、可溶性CD8（sCD8）、IL-2可溶性受体α（IL-2sRα）以反映T细胞炎症反应18-21和RANTES（正常T 淋巴细胞表达和分泌的活性调节蛋白)；单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以衡量肥大细胞的循环活性；血清中转化生长因子-β1（TGF-β1）和IL1 受体拮抗剂（IL-1ra）以衡量循环中抗炎活性；尿液EPX以验证嗜酸性炎症的发生；尿液中组胺、甲基组胺代谢情况反应早期抗原应激反应22，23。

特应性湿疹评价
特应性湿疹的严重程度通过SCORAD评分来评价，该评分系统是欧洲的特应性皮炎评分标准24。

分别在分组前，2个月、6个月后对湿疹评分。

面积计算使用九分法，严重程度以红斑、浮肿和/或丘疹、脱皮、苔藓形成和干燥各级分数的总和计算，主观临床表现包括瘙痒、失眠，主要由家长估测评分。

SCORAD评分由下述公式计算而得：面积/5+3.5×严重程度+主观评分。

免疫评价
分组前、实验开始2个月后、6个月后分别采集静脉血和尿液，并保存于-70℃等待检测。

采用酶联免疫吸附法，试剂盒含有sCD4、sCD8、IL-2sRα、sICAM-1、IL-1ra、RANTES、MCP-1：购于R&D Systems公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国；TNF-α、GM-CSF、TGF-β1：购于Genzyme公司，剑桥，马萨诸塞州，美国；稀释尿样中甲基组胺和EPX浓度用放射免疫测定法测定，反应试剂产于Pharmacia&Upjohn Diagnostics公司，乌普萨拉，瑞士，尿样测验结果以甲基组胺/μg或肌酐中EPX/mmol表示。

生长和营养情况
本实验参照其它文献25评价了营养摄入。

家长分别在干涉的前后3天连续记录营养摄入，固体和液体食品量经家用仪器测量，用AIVO程序计算营养摄入量，参照芬兰营养数据表和生产数据表26。

定量测量婴儿的母乳摄入量。

体重和体长用电子秤和婴儿身长量板分别在使用彻底水解配方奶粉前，试验2个月，6个月时测量。

其他营养参数如血清中白蛋白浓度、前白蛋白浓度、尿素浓度和碱性磷酸酶后续进行了测量。

数据分析
测量数据取平均值为（95%的置信区间CI）的中间值和四分位值（IQR），并用Ｈ检验法比较实验组的SCORAD评分，以避免重复配对实验，同时用以比较各组之间免疫变量基线的改变。

经威氏符号秩次检验，数据具有统计学意义。

ANOVA用以比较配方奶粉摄入和各组间营养变量，x2试验以比较三组婴儿临床症状的改善情况。

斯皮尔曼等级相关以测定尿样甲基组胺和EPX浓度与特应性湿疹之间相关性，从而显示特应性湿疹的严重程度。

（SCORAD评分）。

结果
益生菌对特应性湿疹的作用
母乳喂养期，SCORAD评分为16（7-25），中间数（IQR）。

断奶服用完全水解配方奶粉后，患儿评分降低，显示情况明显缓解（创面、程度、主观评定），但反应程度各组不同（图1）。

2个月后SCORAD评分显示，仅服用益生菌的组中出现病情好转，LGG组9/9的患儿病情缓解，未添加益生菌组4/9患儿病情缓解：P=0.002。

Bb-12组评分降至0（0-3.8），LGG组评分为1（0.1-8.7），未添加组评分13.4（4.5-18.2）。

6个月后三组SCORAD评分接近，中位数（四分位值）为0（0-6.6）。

图1. SCORAD评分，中间值（四分位值）。

特应性湿疹创面、严重程度的评价和症状（瘙痒、失眠）随机分组前及试验2个月后的评估，（空白柱表示未添加益生菌组，密集斜线柱表示Bb-12添加组，斜线柱表示LGG添加组）小图：分组前和试验2个月后尿样嗜酸性粒蛋白X在不同组中的浓度
益生菌对免疫参数的影响
服用益生菌的患儿组试验2个月后血清sCD4降低（表1）；H检验法显示三组的显著不同（P=0.005）。

患儿食用配方奶粉后，三组血清sCD8和IL2sRα均降低。

血清TGF-β1受益生菌调节（P=0.007，H检验法），但因益生菌群不同，调节作用不同：Bb-12添加组降低（P=0.04），LGG添加组升高（P=0.07）.而IL-1ra、TNFα、GM-CSF、slCAM-1、RANTES和MCP-1α的血清浓度不收益生菌影响。

表1 三组患儿（完全水解配方奶粉EHF未添加益生菌组、Bb-12添加组、LGG添加组）sCD4、sCD8、IL2sRα和TGF-β1在试验前（前），2个月后（后）的血清浓度变化。

EHF+ EHF+
EHF Bb-12 LGG 前后前后前后sCD4 5118 4465 5601 1404 5540 4458
ρg/mL （4735—
5555）
（3482—
5235）
（5092—
6189）
（1021—
1635）
(5151—
6484)
(3507—4601)
sCD8 15 10 12 11 11 8 Ng/mL （10—17）（9—12）（11—17）（9—12）(8—13) (7—11) IL2sRα4307 3605 3605 3251 4618 3739
ρg/mL （3789—
4429）
（2927—
3981）
（2927—
4885）
（3019—
3387）
(3605—
5554）
(3527—5161)
TGF-β1 75 75 76 46 54 68
ng/mL （63—82）（67—87）（75—82）（39—55）（50—62）（56—82）*P<0.05 对比基线测量（各组间经H检验法测定在统计学上有显著差异）
试验前母乳喂养时，尿样EXP浓度与SCORAD评分密切相关（rho=0.53，P=0.01），甲基组
胺尿样浓度与之无相关性（rho=0.24，P=0.27）。

益生菌添加组中，尿样EPX明显减少，Bb-12
添加组P=0.01，LGG添加组（P=0.04）：图1小图
生长与营养状况
参加实验时，母乳喂养包含的营养：108（97-120）mL/kg，平均值为（95%的置信区间CI）。

2个月后，各组在配方奶粉的营养方面相当，平均值为（95%的置信区间CI）：未添加益生
菌组75（63-88）mL/kg，Bb-12添加组73（63-88）mL/kg，LGG添加组76（70-82）mL/kg；
P=0.96。

每组患儿能量消耗分别占各自摄取总量的53（38-68）%，52（42-62）%和56（50-62）%，
P=0.85。

6个月后，消耗量下降至63（56-69）mL/kg, 例如：42(37-47) kcal/kg [177(156-199)
kJ/kg]，但固体食物摄入量同比增加：64(59-70)kcal/kg [270(245-294)kJ/kg]，相当于总能量摄
取的60(56-65)%。

试验后6个月后随访时，平均益生菌摄入量为3-8×1010cfu/d。

配方奶粉储藏时基本无益生
菌数量减少。

随访期间所有患儿生长发育正常。

平均值为95%置信区间的年龄别身高标准差在试验前、2
个月后、6个月后分别为-0.04（-0.41—0.33）、-0.11（-0.46—0.22）、0.0（-0.43—0.42）。

试
验前，平均值为95%的置信区间所取的血清白蛋白、前白蛋白、碱性磷酸酶浓度均在正常范围：41（40—42）g/L，0.14（0.14—0.15）g/L，672（564—780）U/L，并且后期随访中无变化。

血清尿素浓度在母乳喂养期稍低，仅1.98（1.79—2.16）mmol/L，平均值为95%置信区间的取值：正常范围2.0—6.0mmol/L，益生菌添加剂组在2个月后随访中显示该营养参数提高：Bb-12添加组4.1（3.4—4.7），LGG添加组3.3（2.7—3.7）。

对比非益生菌添加组2.9（2.1—3.7）mmol/L，平均值为95%置信区间取值：P=0.02。

6个月后三组浓度正常均近似与4.0（3.5—4.4）mmol/L。

讨论
人类肠道菌落是复杂的代谢活性生态系，早年逐步生成27。

肠道菌落的生成初期至关重要，任何抗体的免疫应答都在该阶段产生。

因此，微生物群，主要是益生菌，可能在新生儿免疫系统的生成阶段起作用，这一理念在近年来动物实验中得到了证实，消化道相关的淋巴组织参与微生物集群现象28。

胃肠道可产生IgA-分泌细胞，大大增强了小肠抗原尤其是微生物群落的刺激作用29。

并且微生物集群现象强制性出现在口服免疫耐受人群而非食物致敏人群30，因此消化道菌群的组成差异将直接影响宿主的免疫自稳性。

益生菌的标准是：菌种于人类同源，在人体中宿生与胆汁酸共存，粘附于小肠粘膜1。

Genera 本实验所用菌属乳酸杆菌和双歧杆菌，研究表明与人类嘴唇、胃肠道和泌尿生殖道粘膜表层同源。

益生菌已证实可增强宿主的小肠抵御机制1-6，因此可帮助控制治疗早期过敏反应，是预防特异性疾病恶化的关键。

该疾病治疗的重要性还在于婴儿虽然易发生多种食物过敏25和哮喘31 ，但其免疫记忆尚不完善7，因此，在健康人体消化道特异微生物消耗的基础上，本实验提出特应性疾病免疫应答存在微生物抗原的反作用7，8，另外新近流行病学调查显示早期炎症反应和后期特应性疾病之间存在逆关联32，33也支持本文观点。

本实验表明益生菌能减少婴儿特应性湿疹的创面，缓解症状。

未添加益生菌的试验对照组6个月后病情得以控制，而益生菌添加组，2个月后即能控制病情，说明益生菌可尽快的控制过敏反应。

食物过敏原可能导致过敏体质婴儿产生炎症反应，抑制小肠的屏障作用，引起抗原摄取异常，小肠菌落失衡和致炎细胞因子的释放，进一步导致炎症反应和屏障作用异常34。

失衡菌落常存在病原体，打乱微生物菌群和免疫系统间的平衡：菌群可能引起强烈炎症反应35。

经检验粪TNFα，证实益生菌可减轻小肠炎症反应36，同时大分子肠道吸收作用也证实益生菌可提高胃肠道屏障作用4，平衡消化道微生物环境1。

正如本实验所表明的，益生菌可逆转胃肠道环境，改变炎症反应。

除临床症状减轻和消失外，Bb-12添加组、LGG添加组患儿血清sCD4浓度，尿样EPX浓度的降低也同样表明过敏反应减轻。

目前发现与几种长期炎症中可溶性CD4均有增高显现19，尿液EPX可反映幼儿时期哮喘的过敏反应活动23。

益生菌对于TGF-β1的特异作用显示益生菌可通过几种途径达到逆炎症作用。

实验证实TGF-β1在粘膜炎症逆反应发挥重要作用37，因此可减轻主观症状，尤其是患嗜酸性食管炎的特应性疾病患者或食胃管返流病人。

实际上两过程中可溶性CD4，衡量着T细胞活性，TGF-β1的升降，调节IgA的产生并诱导低剂量口服耐受38，39，因此，两组反应结果毫无疑问相类似。

本实验首次对特异微生物在过敏反应中的可能作用做出临床证明，但消化道微生物群落和稳定宿主免疫环境之间的相互关系仍有待进一步研究。

本研究在一定程度上就不同菌落的免疫调节机理、协同作用和生长因子做出了解释，希望为进一步研究针对不同疾病的功能性食物提供切入点，从而开发过敏反应预防和治疗的新方法。