草鱼出血病标准

ICSXX.XXX
BXX
DB 湖南省地方标准
DB/T XXX (200x)
草鱼出血病检疫技术规范
Technical code of quarantine for hemorrhage disease of grass carp
2006-XX-XX发布2006-XX-XX实施湖南省质量技术监督局发布
目次
前言 (Ⅲ)
1 范围 (1)
2规范性引用文件 (1)
3 检样质量要求 (1)
4 检疫方法 (1)
4.1 群体检疫 (1)
4.1.1 免疫核实 (1)
4.1.2 现场检查 (1)
4.2 流行病学调查 (1)
4.3 解剖检查 (1)
4.4 病理学检查 (2)
4.5 病原电镜检查 (2)
4.6 免疫学检验 (2)
4.6.1 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (2)
4.6.2 葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (2)
4.7 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (2)
5 非草鱼出血病的判定 (2)
6 无害化处理 (2)
附录A（规范性附录）流行病学调查 (3)
附录B（规范性附录）斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (4)
附录C（规范性附录）葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (5)
附录D（规范性附录）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (6)
参考文献 (8)
前言
本标准为强制性标准。

本标准附录A、B、C、D为规范性附录。

本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。

本标准起草单位：湖南省水生动物防疫检疫站,湖南农业大学动物科技学院本标准主要起草人：肖光明，江为民，肖克宇，黄兴国。

草鱼出血病检疫技术规范
1 范围
本标准规定了草鱼出血病(hemorrhage disease of grass carp )的检样质量要求、检疫方法、非草鱼出血病的判定和无害化处理等内容。

本标准适用于草鱼出血病的检疫。

2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

DB43/221-2004 水生动物检疫规程，
中华人民共和国进出境动植物检疫法。

3 检样质量要求
被检病鱼5～7尾，材料新鲜无污染，病变具有代表性。

4 检疫方法
4.1 群体检疫
4.1.1 免疫核实
经核实已按规定接种合格的草鱼出血病疫苗，注射后一月内未发现疑似草鱼出血病的患病鱼，并处在免疫有效期内，可认为免疫符合要求。

如未接种疫苗，或接种不符合要求的疫苗，或接种疫苗后又发现疑似草鱼出血病的病鱼，必须进行补充免疫接种，至免疫有效期开始时未发生异常，可认为免疫合格；如免疫接种后再发生疑似草鱼出血病的病鱼，必须进行临床检查和实验室检验，在排除草鱼出血病染疫的可能性之后，方可认为免疫合格。

4.1.2 现场检查
仔细检查草鱼有无异常表征，如发现尾鳍末端变黑，不食，反应迟钝，独游，易失平衡的；或鱼体暗黑，小的鱼种在阳光或灯光透视下，皮下肌肉充血、出血的全部或部分症状，可作疑似草鱼出血病对待，进一步诊断。

4.2 流行病学调查
如发现疑似草鱼出血病，应进行草鱼出血病流行病学调查。

见附录A。

4.3 解剖检查
经4.1、4.2检疫为疑似草鱼出血病的患病鱼，抽样进行解剖检查，根据下述病变之一，可初步判断为草鱼出血病：
a. 口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖及鳍条基部充血，鳃丝呈紫红色出血。

病鱼出血严重时，鳃呈“白鳃”症状。

b. 剥开皮肤，肌肉充血和点状出血，呈鲜红色。

c. 肠壁充血或出血，全肠或局部呈鲜红色，肠壁弹性较好，肠内无食物，粘液较少；肠系膜、周围脂肪、鳔、胆囊、肝、肾有出血点或血丝；个别情况下，鳔及胆襄呈紫红色；当肌肉出血严重时，肝、脾、肾的颜色常变淡。

4.4 病理学检查
经4.1、4.2、4.3 检疫为疑似草鱼出血病的患病草鱼，取其新鲜组织固定、作石蜡切片、H.E染色，用生物显微镜观察，同时，对患病草鱼血液进行显微镜检查。

根据下列病理变化，可诊断为草鱼出血病。

a. 肠上皮细胞肿胀，杯状细胞有少量增加，肠上皮与固有层剥离，严重时肠上皮完全脱落，固有层和粘膜下层有大量出血，肠腔中有大量红细胞和成片脱落的肠上皮。

b. 小血管管壁广泛受损，形成微血检，脏器组织梗死样病变。

c. 在肝细胞等的胞浆内可看到嗜酸性包涵体。

d. 红细胞数、白细胞数和血红蛋白量显著地低于健康鱼。

e. 白细胞血式中，淋巴细胞百分率显著地低于健康鱼，单核细胞百分率则显著地高于健康鱼。

4.5 病原电镜检查
草鱼出血病病原为草鱼出血病病毒（Grass Carp Hemorrhage Virus，简称GCHV）。

经4.1、4.2、4.3检疫为疑似草鱼出血病鱼的患病草鱼，取其肝、肾、脾、肠、肌肉、血管等组织，戊二醛固定，常规制作超薄切片，电子显微镜观察。

如在电子显微镜下观察到GCHV病毒，可确诊为草鱼出血病。

4.5 免疫学检验
经4.1、4.2、4.3检疫为疑似草鱼出血病的患病草鱼，采用下述方法之一可快速确诊。

4.5.1 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)。

见附录B。

4.5.2 葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA）。

见附录C。

4.7 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测
经4.1、4.2、4.3检疫为疑似草鱼出血病的患病草鱼，可进行GCHV病毒逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测，根据琼脂糖核酸电泳观察核酸带，判断是否有GCHV病毒，如检测出GCHV病毒，可诊断为草鱼出血病。

见附录Ｄ。

5 非草鱼出血病的判定
草鱼群体经检疫免疫合格，临床无异常；或发现疑似病例，经流行病学调查、解剖检查、实验室检疫等综合性判断，证明不是草鱼出血病，应作非草鱼出血病的群体对待。

6 无害化处理
凡检疫为草鱼出血病的患病草鱼和运装器具，必须作无害化处理。

6.1养殖水体用百万分之一的漂白粉溶液全池泼洒消毒；禁止患病草鱼异地（塘）转移或上市；使用过的器具用百万分之十的漂白粉溶液浸泡15min消毒；
6.2病死鱼用锅炉焚烧或加盖生石灰后深埋处理。

（规范性附录）流行病学调查
（规范性附录）
斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)
B1GCHV毒种来源及分离纯化
GCHV毒种取自典型自然发病的出血病病鱼组织，用蔗糖密度梯度离心法分离纯化，电镜及紫外分光光度吸收法测定纯度，并按Farrel等[1974]的9．1OD260nm=lmg／ml测定病毒含量。

B2兔GCHV抗血清的制备及IgG的分离纯化
参照闵淑琴等[1986]方法免疫大白兔，琼脂双向扩散法测定抗血清效价，待滴度达到l：256左右，从颈动脉采血制备血清，经(NH4)2SO4沉淀后用DEAE-SephadexA50柱层析法提纯IgG，紫外分光光度法测定含量。

B3被检病鱼组织材料的制备
取肝脏、肾脏、脾脏、肠道和肌肉等病变组织，经匀浆、离心等处理后加PBS制成10％浓度的组织液供作检测。

B4Dot-ELISA 测定
参照Berger等[1985]方法进行。

将孔径0.22微米的硝酸纤维素膜(NCM)依次浸入去离子水和TBS(0.01mol／L Tris-HCl，pH7.5，0.9％NaCL)溶液各5分钟，然后置于带抽滤设备的点样器上，抽滤点样。

被检样品用PBS倍比稀释，每样品点25μl，37℃干燥lh后用TBS配制的5％BSA封膜l5分钟，然后转入终浓度5～10μl/ml的兔抗GCHV IgG中，37℃孵育lh，用TBS配制的0.05％ NP-40洗涤3次，每次5分钟，然后再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔1gG或辣根过氧化物酶标记的A 蛋白(SPA-HRP，工作浓度1：1000)，37℃作用1h，如上洗涤3次后加底物溶液（0.6％ DAB，用0.05ml／Ltris-Hcl，pH 7.6配制，用之前加H2O2至终浓度0．01％），室温下显色。

以上操作可用一完整的NCM在一平皿内进行，也可用打孔器将NCM打成直径4mm 的小孔片，然后置微孔测定板内进行，检测中同时设正常鱼组织及空白PBS等作对照。

B5阳性结果呈鲜艳的棕褐色斑点，阴性对照为无色。

（规范性附录）
葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA）
C1葡萄球菌菌体试剂
含A蛋白的葡萄球菌(简写SPA(+)菌)试剂。

可从卫生部上海生物制品研究所购买。

C2 GCHV 病毒的提纯和兔GCHV抗血清的制备及纯化
从病鱼组织中提取GCHV病毒参照文献[1]进行。

从染毒的培养细胞中提取GCHV病毒参照文献[2]进行。

兔GCHV抗血清的制备及纯化参照文献[1]进行，以对流电泳测定抗血清效价为1：10。

兔GCHV抗血清也可以购买。

C3待测样品的制备
取病鱼的肝，脾，肾、肠和肌肉等组织．各按1：10(w／v)加PBS液。

匀浆后，3500rpm 离心30分钟，取上清液备用。

正常鱼组织按同法制备．
C4SPA-CoA 试验方法
将冻干葡萄球菌菌体试剂悬浮于lml无菌水中，加入0.1m1兔抗血清，37℃水浴温育3O 分钟，用0.01M，pH7.2的PBS液离心洗涤3次，再悬浮于lm1同一缓冲液中，为标记试剂待用，使用时作1：6稀释。

取待测样品液约20μl．标记试剂约2Oμl在载玻片上用玻璃棒混匀，3分钟后肉眼观察凝集反应程度，并按下述标准作为结果判定。

试验设对照组。

液体透明，试剂凝成粗大颗粒者为“++++”。

液体透明，试剂凝成较大颗粒者为“ +++”，
液体稿透明，试剂凝成小颗粒者为“ ++”，
液体混浊．试剂凝成可见颗粒者为“+”，
液体混浊，试剂无颗粒可见者为“一”。

凡达到“++”及以上凝集反应的样品判为阳性。

“ +”者应加大样品或标记试剂量重作．仍不能达到上述阳性标准，则与“一”者均判为阴性。

（规范性附录）
逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测
D1 病毒RNA抽提
将450μl细胞病变悬液加入450μl CTAB溶液，或者将25～100mg (体积不超过0.1mL！) 样品匀漿后加入900μl 2%CTAB溶液，混匀。

25℃作用2～2.5小时。

加600μl 酚/氯仿/异戊醇（24:24:1）, 用力混合至少60秒。

12,000rpm离心5 分钟，取上层水相（约750μl）。

加650μl氯仿/异戊醇（24:1）, 用力混合至少30秒。

12,000rpm离心5 分钟，取上层水相（约600μl）。

加1.5倍体积（约900μl）的无水乙醇，混匀后-20℃过夜。

15,000rpm 离心30min，小心弃上清，倒置在滤纸上吸干，37℃干燥30min，加11μl水溶解，吹打20下，-80℃冻融一次，做PCR模板。

2%CTAB配方(1.4M NaCl, 20mM EDTA 100 mM Tris-HCl pH=7.5, add 0.25% α-mercaptoethanol just before use)
D2 解二级结构
模板（病毒悬液） 10 μl
引物（R） 1.5 μl
水 3.5 μl
总体积： 15 μl 90℃立即冰浴5-10 min ，离心收集。

(上为固定模板和引物的比例) 。

D3 逆转录
加：5X buffer 5 μl
dNTP (各10 mM) 2 μl
RNA抑制剂 1 μl （20U）
反转录酶AMV 1 μl
水 1 μl
总体积： 25 μl 40℃反应 60min。

再95℃ 10 min灭活。

D4 PCR
加：10Xbuffer 9μl
10X Mg++ 9μl
引物（F） 1μl
引物（R） 1μl
dNTP (各10 mM) 2μl
Taq酶 1μl （20U）
水 52μl
总体积： 100μl 混匀后，在上面加50μl矿物油。

短时间离心，让矿物油在上层。

94℃ 4 min→，94℃ 1 min→57℃ 1 min→72℃ 1.5 min 35次循环, 72℃ 10 min→4℃保温。

扩增755bp片段：
D5 琼脂糖核酸电泳
D5.1倒平板：用TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含0.5 μg/ml EB)。

厚0.5 cm。

D5.2将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液(TBE, 含0.5 μg/ml EB)刚好淹没胶面。

D5.3加样：6μl样品加入2μl样品缓冲液，混匀后加入样品孔。

D5.4电泳：50 mA电泳约0.5小时，溴酚兰达底部时停止。

D5.5紫外灯下观察核酸带。

注意：胶不要太厚。

不要忘记撕掉四周的胶带。

要保持EB的浓度（决定带的亮度）、电泳液的浓度（决定带的形状）、琼脂平板的平整度（决定带是否整齐）。

Mark用1μl（小孔）～1.5μl(大孔)，样品用6（小孔）～10μl(大孔)。

Taq酶和反转录酶最后加，并保持在-20℃。

否则极易失活。

参考文献
1、毛树坚，邵健忠，杭绮等， I989，草鱼出血病的病原研究，水产学报，13(1)：1～5
2、罗毅志，叶雪平等，1989，草鱼出血病病毒的培养以及分离提纯的研究，鱼病简讯，1989年第2-3期
３、李军，王铁辉，陆仁后，陈宏溪，1999，草鱼出血病病毒的研究进展，海洋与湖沼，30（4）：445～453
４、杨广志，罗毅志，叶雪平，I991，葡萄球菌A蛋白协同凝集试验快速检测草鱼出血病病毒的研究．水产学报，15(1) 27～33
５、邵健忠，项黎新，李亚南等，1996，应用Dot-ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究．水产学报，20(I)6～11
６、黄琪琰主编，1994，水产动物疾病学，65～71
７、皮国华等，1995，快速ELISA的建立和应用，病毒学报，11（4）：381～382
８、郑祟德，黄琪琰，蔡完其等，1986．草鱼出血病的组织病理研究．水产学报，10(2)：151～159
９、李军，王铁辉，周立冉等，1997，应用RT-PCR技术对草鱼出血病病鱼组织的初步研究水产学报，21(2)：175～179
10、郭积，2005，免疫学检验中的酶免疫技术，中华检验医学杂志，2005（2）：20～24
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