慢性应激对大鼠淋巴细胞DNA损伤机制的研究

慢性应激对大鼠淋巴细胞DNA损伤机制的研究
冀晓丽;刘继文;袁芳;连玉龙;杨晓燕
【摘要】目的:研究慢性应激对大鼠淋巴细胞DNA损伤机制.方法:选择Wistar成年雄性大鼠18只,建立慢性应激动物模型(实验组).测定大鼠血清皮质醇的含量;电镜观察海马超微结构改变;黄嘌啉氧化酶法测定大鼠血清和脏器中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性;TBA法测定脂质过氧化物(Malondiasldehyde,MDA)含量;彗星实验评价大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤情况.结果:实验组海马超微结构异常;血清SOD活性为(56.70±15.65)U/ml,低于对照组(P＜0.05),MDA含量为(9.21±2.75)nmol/ml,高于对照组(P＜0.05);SOD活性与皮质醇呈负相关(r=0.52,P＜0.05),MDA含量与皮质醇呈正相关(r=0.54,P＜0.05),彗星细胞发生率56.5%,高于对照组(P＜0.05);实验组淋巴细胞DNA损伤率较对照组明显增加(P＜0.05);DNA损伤与MDA含量呈正相关(r=0.53,P＜0.05).结论:慢性应激可损伤海马超微结构,可诱导机体产生过量的自由基,促进脂质过氧化,进而损伤外周血淋巴细胞DNA.
【期刊名称】《新疆医科大学学报》
【年(卷),期】2008(031)001
【总页数】3页(P19-21)
【关键词】慢性应激;脂质过氧化;DNA损伤
【作者】冀晓丽;刘继文;袁芳;连玉龙;杨晓燕
【作者单位】新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室,新疆,乌鲁
木齐,830011;新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R34
随着现代医学模式的转变，应激与健康的关系日益受到人们的关注。

据文献报道，机体对应激刺激的反应是一种动态平衡，应激反应后，机体通过自身调节使机体获得稳定并恢复原状态，但如果应激长期存在，机体最终失去对应激的调节能力，导致心身损害[1]。

因此，无论是人类或是其它动物，应激时都会产生紧张、焦虑、抑郁的情绪反应。

与情绪密切相关的脑边缘系统尤其是海马结构最易受到损害。

海马是脑边缘系统的重要组成部分，与机体的内环境稳定、情绪、学习、记忆、行为等精神活动密切相关。

生物体内一定的自由基水平是维持正常生命活动所必需的，活性氧或氧自由基的增高可能是造成淋巴细胞DNA断裂损伤的重要原因[2]。

本研究通过建立慢性应激动物模型，观察应激时大鼠海马超微结构改变及测定脂质过氧化水平和淋巴细胞DNA的损伤情况，探讨应激状态下脑损害的影响因素及脂质过氧化水平与淋巴细胞DNA损伤的关系。

1 材料和方法
1.1 动物及分组 Wistar成年雄性大鼠18只，体重250～350 g(新疆医科大学实验动物中心提供)。

适应性饲养1周后，随机分为实验组(9只)和对照组(9只)。

1.2 建立动物模型参照文献[3]，大鼠适应性饲养7 d后，于第8天起造模，实验组每笼饲养1只，在21 d内接受不同的刺激，包括足底电击(电流强度1.0 mA，
每隔1 min刺激1次，每次持续10 s，共30次)、冷水游泳(10℃，5 min)、热
应激(45℃，5 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、昼夜颠倒、情绪应
激(空瓶刺激)等，每天随机安排1种，每种刺激平均使用2次。

对照组每笼3只，除不接受刺激外，其他饲养条件与实验组相同。

造模21 d 2组血清皮质醇浓度有
统计学差异，表明动物处于应激状态，应激动物模型建立成功。

1.3 血清皮质醇测定造模21 d后，大鼠颈动脉取血5 ml，以枸橼酸钠(3.8%)1∶9抗凝,随即高速(4 000 r/min)离心5 min,分离出血清,置-20℃冰箱保存待测。

采用
放射免疫分析方法，使用GC-2016型16探头γ放射免疫计数器测定血清皮质醇
浓度。

操作步骤严格按试剂盒说明书要求进行，试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。

1.4 海马超微结构观察由颈动脉戊二醛灌注脑组织，取大鼠海马，戊二醛固定、
保存，按照电镜切片要求切片，透射电镜(JEM-100CXⅡ型)9400倍下观察、拍照。

1.5 脂质过氧化水平测定大鼠颈动脉取血5 ml，以枸橼酸钠(3.8%)1∶9抗凝，随即高速(4 000 r/min)离心5 min,取1.0 ml血清采用黄嘌啉氧化酶法测定SOD活性，取0.2 ml血清用TBA法测定MDA含量，操作步骤均按试剂盒说明书要求进行，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.6 淋巴细胞DNA损伤的测定操作步骤参照Singh等[4]的方法。

采用DNA断
裂分级观察指标, 共观察800个细胞数，按彗星尾部占全部DNA量的比例判断结果：Ⅰ级：无细胞损伤，无彗尾；Ⅱ级：细胞轻度损伤，彗尾不长；Ⅲ级：细胞明显损伤，彗尾明显可见；Ⅳ级：细胞重度损伤，彗尾长平行拖开；Ⅴ级：细胞严重损伤，彗尾长呈扇形(各级彗星细胞见图1、2)。

1.7 统计学处理应用SPSS13.0统计软件包进行t检验、简单相关分析。

2 结果
2.1 一般情况整个实验过程中，随着刺激时间的推移，实验组与对照组相比进食
量减少，明显消瘦，活动减少，反应迟滞，皮毛失去光泽，个别动物有掉毛现象；对照组大鼠活动正常，被毛舒展光亮。

2.2 血清皮质醇水平实验组大鼠血清皮质醇浓度为(29.96±
3.13)mg/L，对照组血清皮质醇浓度为(20.55±3.06) mg/L，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 海马超微结构改变电镜下可见，海马区神经细胞核仁结构不明显，部分有碎裂，染色质轻度凝集靠近核膜边缘，线粒体肿胀，空泡变性，粗面内质网模糊不清，核糖体颗粒减少，神经纤维髓鞘板层分离，轴索结构紊乱(见图3、4)。

图1 彗星细胞(Ⅱ级，Ⅲ级，Ⅳ级)
图2 彗星细胞(Ⅰ级，Ⅴ级)
图3 对照组海马神经元细胞(×9 400倍)
图4 实验组海马神经元细胞(×9 400倍)
2.4 应激对脂质过氧化水平的影响实验组大鼠SOD活性为(56.70±15.65) U/ml，低于对照组(77.07±20.29) U/ml；MDA含量(9.21±2.75) nmol/ml，较对照组(5.44±
3.65)nmol/ml明显升高(P<0.05)，提示应激刺激使大鼠脂质过氧化水平增加。

2.5 皮质醇和脂质过氧化的关系血清皮质醇浓度与SOD活性呈负相关(r=-0.52，
P<0.05)，与MDA含量呈正相关(r=0.54，P<0.05)。

提示慢性应激状态下，机体的自由基代谢发生了改变。

2.6 应激对大鼠淋巴细胞DNA损伤实验组彗星细胞的发生数和彗星细胞的发生率(DNA损伤率)与对照组相比差异有统计学意义，其中DNA断裂为IV和V级的比重高于对照组，彗星细胞总发生率也高于对照组(P<0.05)，见表1。

说明慢性应激可以导致淋巴细胞DNA损伤率增加。

表1 大鼠淋巴细胞的彗星细胞分布比较[个 (%)]组别Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级Ⅳ级Ⅴ级彗星细胞总发生率(%)实验组348 (43.5)157 (19.6)125 (5.6)103 (12.9)∗67 (8.4)∗56.5∗
对照组485 (60.6)138 (17.3)100 (12.5)68 (8.5)9 (1.1)39.4
注：与对照组比较, *P<0.05
2.7 脂质过氧化和淋巴细胞DNA损伤的关系淋巴细胞DNA损伤率与MDA含量
呈正相关(r=0.53，P<0.05),与SOD活性无相关性(r=0.24，P>0.05)。

提示脂质
过氧化损伤淋巴细胞DNA。

3 讨论
机体对应激刺激的反应是一种动态平衡，快速应激反应时，机体通过自身调节以达到平衡状态，但如果应激强度过大或长期慢性应激，机体可出现心身功能损害。

传统应激学说认为，HPA轴的激活和高水平的糖皮质激素与海马损伤密切相关[5]。

应激引起中枢和外周神经内分泌系统的广泛改变，通过海马以及海马以外部位使HPA轴功能亢进，引起谷氨酸堆积，造成海马的损伤。

本研究发现，实验组海马SOD活性降低，与对照组相比差异有统计学意义。

电镜观察可见，海马区神经细
胞出现超微结构的改变，核仁结构不明显，部分有碎裂，染色质轻度凝集靠近核膜边缘，线粒体肿胀，空泡变性，神经纤维髓鞘板层分离，轴索结构紊乱。

提示应激状态时脑组织产生自由基过多，SOD活性降低，清除自由基能力减弱，自由基在
脑组织中大量蓄积，对神经细胞产生一定损害，造成海马超微结构的损伤，表明应激状态下过量的自由基对脑细胞结构造成损坏，是应激障碍脑损害的重要因素，与文献[6,7]报道结果相一致。

持续的应激状态，可使机体自由基水平增高，氧化与
抗氧化失衡，导致氧化应激，自由基攻击靶分子，造成组织、器官及各种生物分子不同程度的损伤。

本研究通过行为学改变和血清皮质醇水平作为应激反应动物模型成功的测量指标，结果显示实验组大鼠的血清皮质醇浓度明显升高且有行为学改变，因此建立的应激动物模型是成功的。

在正常的生理情况下，机体自由基的产生与清除处于平衡状态。

有研究认为，应激是导致人体内产生氧自由基的主要原因，应激可使机体的自由基水平明显增高。

氧
自由基过量时，可以攻击包括DNA在内的几乎所有的生物分子，引起生物膜和生物大分子的脂质过氧化损伤,产生多种不同的后果(如免疫功能受损、肿瘤、畸形、衰老等)[8]。

活性氧或氧自由基的增高是造成淋巴细胞DNA断裂损伤的重要原因。

本研究发现,实验组动物血清SOD活性降低， MDA含量明显升高，彗星细胞的频数分布和发生率(DNA损伤率)升高(P<0.05)。

淋巴细胞DNA损伤和脂质过氧化有相关性，提示应激可能诱导机体产生过量的自由基，SOD活性降低，脂质过氧化
物含量增加，促进脂质过氧化损伤，过量的自由基穿透、扩散、进入细胞核，直接攻击DNA分子，使DNA链断裂受损，干扰DNA的复制，使细胞受损。

【相关文献】
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