祛斑汤对小鼠皮肤_MSH表达影响的研究_李艳

剂，其功效为滋阴养血、益气固表、疏风散邪。

当归、川芎、白芍、生地滋阴养血，使营阴内守，以达活血通络、调和营血之效，四味药合用滋阴以治久病伤津耗气，营卫不和之本，故为君药。

制首乌味苦、甘、涩，入肝肾经，能补肝肾、益精血，养血润肤；鸡血藤味苦、微甘，温，有行血补血之效，二者合用则养血之功益增，又能补而不滞，兼有行血之妙，与古人“治风先治血，血行风自灭”之旨相符，加上味甘、微温之黄芪行益卫固表、补气运血、托毒外泄之功，防邪内侵，辛甘、微温之防风，走表祛风，辛、苦、寒之地肤子清热利湿、疏风止痒，助君药发挥作用，以上诸药共为臣药。

白藜芦味苦辛，性平入肝经，可宣散肝经风邪，以祛风明目、除风止痒，僵蚕，蝉衣均属虫类药，久病则风邪入络，故取其搜
收稿日期：2012－11－15
基金项目：四川省教育厅青年基金（10ZB074）
作者简介：李艳（1975－），女，四川射洪人，讲师，博士研究生，研究方向：色素性皮肤病的诊治。

通讯作者：艾儒棣（1944－），男，重庆人，教授，博士研究生导师，研究方向：中医皮肤病研究。

风入络、搜剔化瘀通络之用，为佐药。

甘草能调和诸药之性，为使药。

诸药合用，使当归饮子加减方具有养血润肤、祛风之痒之功，对气血两虚证患者，具有调补气血、标本皆治的之用。

本实验研究表明，当归饮子加减方对小鼠皮肤瘙痒反应具有明显的抑制作用，说明该方对皮肤过敏主要的症状有明显的改善作用。

参考文献
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祛斑汤对小鼠皮肤α－MSH表达影响的研究
李艳1，艾儒棣1，肖桦2
（1.成都中医药大学附属医院，四川成都610075；2．成都中医药大学基础医学院，四川成都610075）
摘要：目的:观察祛斑汤对雌性C57BL/6J小鼠皮肤α－MSH表达的影响，为探索该方剂治疗黄褐斑机制提供实验依据。

方法:将雌性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、祛斑汤低剂量(10g/kg)组、中剂量(20g/kg)组、高剂量(40g/ kg)组、维生素C组。

各组小鼠灌胃给药30日后皮肤取材。

采用免疫组化法观察皮肤α－MSH表达，并用χ2检验进行统计学分析。

结果:祛斑汤高剂量组α－MSH阳性表达率低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

结论:高剂量祛斑汤能降低雌性C57BL/6J小鼠皮肤中α－MSH表达、抑制黑素合成。

关键词：祛斑汤;黄褐斑;α－MSH
中图分类号：R285．5文献标志码：A文章编号：1000－1719（2013）05－1028－03
Study on Effect of Quban Decoction on Expression ofα－MSH in Mice Skin
LI Yan1，AI Rudi1，XIAO Hua2
（1.The Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu610075，Sichuan，China；
2.Fundamental Medical Academy of Chengdu University of TCM，Chengdu610075，Sichuan，China）
Abstract：Objective：To observe the effect of Quban Decoction on expression ofα－MSH in the female C57BL/6J mice skin and provide the experimental basis for exploring deeply the mechanism of treating melasma by the prescription．Methods：Female C57BL/6J mice were randomly divided into the blank control group，the Quban Decoction low dose group（10g/kg），the middle dose group（20g/kg），the high dose group（40g/kg）and the vitamin C group．Take the skin from mice fed with drug for30days．Use immunohistochemical techniques to observe the expression ofα－MSH and the result was analyzed using theχ2test statisti-cally．Results：The positive expression rate ofα－MSH in the high dose group was lower than that of the blank control group．The difference inα－MSH expression between the high dose group and the blank control group was statistically significant（P＜0.01）．Conclusion：Quban Decoction can reduce the expression ofα－MSH in female C57BL/6J mice skin and inhibit melanin synthesis．
Key words：Quban Decoction；melasma；α－MSH
黄褐斑是一种临床常见而又难以治愈的皮肤病，中医药治疗本病，疗效优于单纯西药治疗。

以圣愈汤为基础，加菟丝子、泽泻而成的祛斑汤治疗黄褐斑，具有显著疗效。

胡冰［1］报道本方治疗黄褐斑56例，3个月后观察疗效。

参照黄褐斑的临床诊断和疗效标准［2］，基本治愈31例，好转19例，无效6例，总有效率89．29%。

本文选用常用于色素性疾病研究的动物C57BL/6J小鼠，通过相关实验观察该方剂对C57BL/ 6J小鼠皮肤中α－MSH表达的影响，深入探索该方剂抑制黑素合成的作用机理。

1材料与方法
1.1动物
SPF级雌性C57BL/6J小鼠100只（由四川大学华西实验动物中心提供），体重为（18ʃ2）g，8周龄，合格证号：SCXK（川）2009－09。

1.2药物
祛斑汤药物组成：黄芪30g，泡参30g，制首乌30 g，当归20g，川芎10g，白芍20g，菟丝子15g，泽泻15 g。

药物购于成都五块石中药市场，由成都中医药大学中药教研室鉴定。

阳性对照药物为维生素C片，0.1 g/片（太极西南药业有限公司）。

1.3主要试剂
α－MSH兔抗鼠IgG（北京博奥森生物技术公司）；生物素化山羊抗兔IgG（北京金桥生物技术公司）；DAB显色试剂盒（北京博奥森生物技术公司）。

1.4仪器
RM2135型石蜡切片机（德国LEICA公司）；LEI-CA DM3000光学显微镜（德国LEICA公司）。

图像获取采用LEICA图像系统。

1.5方法
1.5.1祛斑汤制备祛斑汤由成都中医药大学附属医院药剂科制备。

制备方法：取中药加相当于药材量10倍的蒸馏水浸泡2h，第一次回流提取1．5h，滤过后药渣再加10倍量水继续提取1h，合并2次滤液，于加热浓缩成每毫升相当于原方生药材的2g的药液。

4ħ保存备用。

灌胃前将药物配成低浓度（0.5g/ mL）、中浓度（1g/mL）、高浓度（2g/mL）。

1.5.2动物处理SPF级雌性C57BL/6J小鼠100只，随机分成祛斑汤低、中、高剂量组、阳性对照组和空白对照组。

祛斑汤低、中、高剂量组小鼠灌胃剂量分别为10g，20g，40g生药/（kg·d）（相当于临床用量的5、10、20倍）。

小鼠适应性饲养2d后，每只小鼠按0.2mL/10g于下午3：00灌服相应浓度中药1次。

阳性对照和空白对照组灌服维生素C0.05g/kg（相当于临床用量的10倍）和等量蒸馏水。

灌胃30日后将小鼠背部脱毛，腹腔麻醉，常规固定，取皮肤标本，10%甲醛固定，常规石蜡切片备用。

1.5.3免疫组织化学检测进行链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶连接（S－P）常规染色。

切片脱蜡至水，3%H2O2去除内源性过氧化氢酶；枸橼酸缓冲剂微波加热8min；PBS液冲洗5minˑ2次；加5%BSA液，加α－MSH兔抗鼠IgG；PBS液冲洗2minˑ3次，加生物素化山羊抗兔IgG；PBS液冲洗2minˑ3次，加HRP 标记链霉亲和素；PBS液冲洗2minˑ3次，加DAB显色液；苏木素复染，脱水、透明、封片。

1.5.4结果判断200倍光学显微镜下，每张切片随机选择20个视野观察皮肤α－MSH表达阳性细胞。

镜下角质形成细胞和黑素细胞胞浆或细胞外基质出现黄色或棕黄色或棕色颗粒状或团块状者为阳性表达。

观察α－MSH表达阳性细胞的数量和细胞的着色深浅。

采用二级计分法作为评分标准判断结果（阳性和强阳性计入阳性率范围）。

根据20个视野下阳性细胞数占总细胞数的比例分为4级：＜10%计为0分；11% 40%计为1分；41% 70%计为2分；＞71%计为3分。

根据着色深浅分4级：浅黄色计为0分；黄色计为1分；棕黄色计为2分；深棕色计为3分。

以上两种分级计分相加小于2分为阴性（－），2 3分为弱阳性（+），4 5分为阳性（++），6分为强阳性（++ +）。

评分标准见表1。

表1评分标准
结果阴性（－）弱阳性（+）阳性（++）强阳性（+++）着色深浅浅黄色黄色棕黄色深棕色
阳性细胞比值＜10%11% 40%41% 70%＞71%分值0123
1.5.5统计学方法应用SPSS13.0进行统计学分析，多组间α－MSH阳性表达率比较采用χ2检验，以P＜0.01时为差别有统计学意义。

2结果
2.1免疫组化染色
光镜下，α－MSH表达定位于小鼠表皮角质形成细胞和毛囊黑素细胞胞浆或细胞外基质，为黄色或棕黄色或深棕色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布。

各组小鼠表皮角质形成细胞和毛囊黑素细胞胞浆或细胞外基质中α－MSH呈强阳性、阳性、弱阳性、阴性表达的例数有差异。

强阳性、阳性、弱阳性、阴性表达结果见图1 4。

图1α－MSH在C57BL/6J
小鼠毛囊和表皮中强阳性
表达（IHCˑ200
）
图2α－MSH在C57BL/6J
小鼠毛囊和表皮阳性
表达（IHCˑ200
）
图3α－MSH在C57BL/6J
小鼠毛囊和表皮中弱阳性
表达（IHCˑ200
）
图4α－MSH在C57BL/6J
小鼠毛囊和表皮中阴性
表达（IHCˑ200）
2.2祛斑汤对小鼠皮肤α－MSH表达的影响
为避免假阳性，弱阳性表达不计入阳性率范围，阳性和强阳性表达计入阳性率范围。

祛斑汤组和维生素C组阳性表达率低于空白对照组。

采用χ2检验比较祛斑汤高、中、低剂量组、维生素C组与空白对照组阳性表达率的差异，高剂量组与空白对照组α－MSH表达的差别有统计学意义（P＜0.01），其他组与空白对照组α－MSH表达的差别无统计学意义（P＞0.01），提示高剂量祛斑汤能降低小鼠皮肤α－MSH阳性表达。

结果见表2。

表2祛斑汤对小鼠皮肤α－MSH表达的影响
组别
剂量
（g/kg）
α－MSH表达
－++++++
合计阳性率（%）
空白对照组06682070
祛斑汤组4088222020
祛斑汤组2028822050
祛斑汤组1035842060
维生素C组0.0566622040
3讨论
黄褐斑，属中医“肝斑”“黧黑斑”“面尘”等范畴，是一种获得性色素沉着性皮肤病。

传统医学认为黄褐斑的病因病机较为复杂。

隋代巢元方《诸病源候论·面黑皯候》云：“面黑皯者，或脏腑有痰饮，或皮肤受风邪，皆令气血不调，致生黑皯”。

认为“黑皯”病因是痰饮渍脏、腠理受风而致气血不调，不能荣于皮肤。

后世多以此观点为根本，结合自身临床经验，不断完善和发展。

明代陈实功《外科正宗·女人面生黧黑斑》记载：“黧黑斑者，水亏不能制火，血弱不能华肉，以致火燥结成斑黑，色枯不泽”，指出黄褐斑是由气血不足，肾阴亏虚不能制火，肾水不能上承，以致黑斑［3］。

历代医家多认为肝、脾、肾是常见受损的脏器。

肝、脾、肾三脏功能失调均可导致黄褐斑，其病机关键为湿浊瘀毒阻滞脉络［4－5］。

成都中医药大学皮肤科艾儒棣教授认为本病以虚为本，以瘀为标，与肝、脾、肾三脏功能关系密切。

肝郁、脾虚、肾虚是发病之因，尤以肾虚为甚。

脏腑功能失调致气机不畅、气血瘀滞，不能润泽面部肌肤，则形成黄褐斑。

针对黄褐斑病因病机，艾儒棣教授提出“培补肝肾以治其本、行气化瘀以治其标”的思想，临床上以圣愈汤为基础，加菟丝子、泽泻而成祛斑汤治疗黄褐斑，全方具有补益肝肾、益气养血、化瘀祛斑之功，临床应用具有显著疗效。

现代医学证实黄褐斑是由于黑素细胞活性增加，黑素合成增多而形成的。

目前相关研究证实黑素生成是一个复杂的过程，黑素合成受酪氨酸酶家族和Pmel 家族调控［6］。

酪氨酸酶家族包括酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白－1，酪氨酸酶相关蛋白－2；Pmel基因家族包括Pmel－17位点、鸡黑素体基质蛋白。

两者共同参与了黑素合成的调控。

此外，黑素合成还受到一些神经内分泌激素的影响，其中α－黑素细胞刺激素（α－MSH）尤为重要。

α－MSH是一种由13个氨基酸残基构成的神经内分泌激素，主要在脑垂体中产生并释放入血，作用于全身各靶组织。

α－MSH还可在消化道、肺、皮肤等其他部位形成，人类血循环中α－MSH水平很低，所以正常情况下α－MSH对皮肤黑素合成的调控作用主要是由皮肤源性α－MSH完成。

皮肤源性α－MSH主要通过皮肤细胞自分泌和旁分泌产生。

日光的照射、表皮源性细胞因子如白细胞介素－1（IL －1）和环磷酸腺苷（cAMP）通道的激活，均可刺激表皮黑素细胞、毛囊黑素细胞、表皮角质形成细胞局部合成和释放α－MSH［7］。

α－MSH与黑素细胞表面的黑皮素－l受体（MC1R）结合，激活腺甘酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，进而激活cAMP依赖蛋白激酶，使酪氨酸酶（TYR）及酪氨酸酶相关蛋白－1（TRP－1）、酪氨酸酶相关蛋白－2（TRP－2）活性增强，黑素合成增加。

因此α－MSH在色素代谢过程中具有重要的调控作用。

利用动物实验研究α－MSH 的表达情况，对色素性疾病发病机理的探索具有积极意义。

本实验用不同浓度祛斑汤给小鼠灌胃30天后，皮肤取材，通过免疫组化染色方法观察皮肤α－MSH表达。

各组小鼠皮肤α－MSH阳性表达率有差别，空白对照组阳性表达率最高，为70%，高剂量组阳性表达率为20%，中、低剂量组、阳性对照组阳性表达率分别为50%、60%、40%。

高剂量组与空白对照组比较，α－MSH表达差别有统计学意义，说明高剂量祛斑汤能降低小鼠表皮角质形成细胞和毛囊黑素细胞α－MSH 表达，减少α－MSH的聚集。

中、低剂量祛斑汤和维生素C也能降低α－MSH表达，但与空白对照组比较，差别无统计学意义。

综上从实验结果推测，高剂量祛斑汤可以通过降低α－MSH表达这一环节来抑制黑素生成，从而治疗黄褐斑。

同时，本实验提示我们在色素性皮肤疾病研究中，可将α－MSH作为一个较酪氨酸酶更为深入的指标，用来探索色素性皮肤疾病的发病机理。

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