液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810724650.9
(22)申请日 2018.07.04
(66)本国优先权数据
201810409663.7 2018.05.02 CN
(71)申请人 梧州市食品药品检验所
地址 543000 广西壮族自治区梧州市万秀
区西环路中段198号
(72)发明人 罗达龙　黄林杰　林冬杰　赖秀梅　
姚泳成　
(74)专利代理机构 广州市越秀区海心联合专利
代理事务所(普通合伙)
44295
代理人 蔡国　黄为
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
(54)发明名称
液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法
(57)摘要
本发明公开了一种检测血液中两性霉素B含
量的方法，包括以下步骤：(1)标准溶液制备及绘
制标准曲线；(2)血液样品预处理：采用抗凝管采
集血液，于8℃以下保存，取待检测血液样品，离
心3～5min，分离血清，取血清加入去蛋白剂去除
蛋白，离心3～5min，取上清液备检；(3)将步骤
(2)所述上清液放入高效液相色谱串联质谱进行
分析，得到血液中两性霉素B含量。

本发明特异性
强、
准确度高和灵敏度高。

权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 108760933 A 2018.11.06
C N 108760933
A
1.一种液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准溶液制备及绘制标准曲线：精密称取两性霉素B标准品，配制成浓度不同的标准工作液，采用超高液相色谱串联质谱联用仪分别将标准工作液定量进样，绘制色谱图的峰高对组分含量的标准曲线；
(2)血液样品预处理：采用抗凝管采集血液，于8℃以下保存，取待检测血液样品，离心3～5min，分离血清，取血清加入去蛋白剂去除蛋白，离心3～5min，取上清液备检；
(3)将步骤(3)所述上清液采用超高液相色谱串联质谱联用仪进行上样分析，从色谱图上测得所述上清液的峰高，代入所述标准曲线，获得两性霉素B含量。

2.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中标准工作液的配制，将标准品10mg置于10ml容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，制成1mg/mL标准品储备液，量取0.1mL标准品储备液，置于100mL容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，制成1μg/mL标准中间液，量取1mL，2mL，5mL，1mL和5mL标准中间液，分别置于100mL，100mL，100mL，10mL和10mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成浓度分别为10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL的标准工作液。

3.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(3)中，色谱条件：色谱柱：Agilent C18柱100×2.1mm，2.6μm；流动相A为0.1％甲酸-5mM甲酸胺，流动相B为乙腈，采用的梯度洗脱程序为0～0.5min ，A.90％，
B.10％；0.5～3.5min，A.90％→10％，B.10％→90％；3.5～8min，A.10％，B.90％；后运行时间1.5min；流速0.4mL/min；柱温35～40℃；进样量1～10μL。

4.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(3)中，质谱条件：离子源ESI，正离子模式下以MRM进行扫描，干燥气温度100℃，雾化器压力25psi，鞘气温度120～150℃，鞘气流速10～15L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，两性霉素B选择离子对母离子为m/z924.4，子离子为m/z328.9，m/z312.8，m/z110.9，碰撞能量均为70V，裂解电压为为40V～80V，驻留时间均为100ms。

5.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用抗凝管采集血液后，72h内进行检测。

6.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所得上清液3小时内进行检测。

7.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，待检测血液样品采用2500-3500r/min的转速分离血清，加入去蛋白剂的血清采用10000-15000rpm的转速获取上清液。

8.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，血清与去蛋白剂的体积比为1-3:4-6。

9.根据权利要求1所述的液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，保存温度为2～8℃。

权　利　要　求　书1/1页CN 108760933 A
液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法
技术领域
[0001]本发明涉及两性霉素B含量的检测，尤其涉及液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法。

背景技术
[0002]近年来，随着免疫缺陷人群的增多，广谱抗生素的广泛使用，侵袭性真菌感染发病呈上升趋势，已称为威胁人类健康的重要公共卫生问题，治疗深部真菌感染的两性霉素B是目前治疗侵袭性真菌感染最有效的药物，目前尚无适当的可替代药。

但临床使用时会产生比较严重的不良反应，尤其肾毒性较为突出。

因此，建立一个有效灵敏的两性霉素B血药浓度测定方法，用以研究其相关临床药动学规律，对于制订个体给药方案，提高治疗水平，达到临床安全、有效、合理的用药十分重要。

目前，鲜有专门检测血液中两性霉素B的方法见报。

发明内容
[0003]本发明的目的之一在于提供一种有效灵敏的血液中两性霉素B含量的检测方法。

[0004]本发明上述目的通过以下技术方案来实现：液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，包括以下步骤：
[0005](1)标准溶液制备及绘制标准曲线：精密称取两性霉素B标准品，配制成浓度不同的标准工作液，采用超高液相色谱串联质谱联用仪分别将标准工作液定量进样，绘制色谱图的峰高对组分含量的标准曲线；
[0006](2)血液样品预处理：采用抗凝管采集血液，于8℃以下保存，取待检测血液样品，离心3～5min，分离血清，取血清加入去蛋白剂去除蛋白，离心3～5min，取上清液备检；[0007](3)将步骤(3)所述上清液采用所述超高液相色谱串联质谱联用仪进行上样分析，从色谱图上测得所述上清液的峰高，代入标准曲线获得两性霉素B含量。

[0008]所述步骤(1)中，将标准品10mg置于10ml容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，制成1mg/mL标准品储备液，量取0.1mL标准品储备液，置于100mL容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，制成1μg/ml标准中间液，量取1mL，2mL，5mL，1mL和5mL标准中间液，分别置于100mL，100mL，100mL，10mL和10mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成标准工作液。

[0009]所述步骤(1)和步骤(3)中，采用Agilent 1290超高液相色谱进行色谱分析，色谱条件：色谱柱：Agilent C18柱100×2.1mm，2.6μm或同类型色谱柱；流动相A为0.1％甲酸-5mM甲酸胺，流动相B为乙腈，采用的梯度洗脱程序为0～0.5min，A.90％，B.10％；0.5～3.5min，A.90％→10％，B.10％→90％；3.5～8min，A.10％，B.90％；后运行时间1.5min；流速0.4mL/min；柱温35～40℃；进样量1～10μL。

[0010]所述步骤(1)和步骤(3)中，采用Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪进行质谱分析，质谱条件：离子源ESI，正离子模式下以MRM进行扫描，干燥气温度100℃，雾化器压力25psi，鞘气温度120～150℃，鞘气流速10～15L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，两
性霉素B选择离子对母离子为m/z924.4，子离子为m/z328.9，m/z312.8，m/z110.9，碰撞能量均为70V，裂解电压为为40V～80V，驻留时间均为100ms。

[0011]所述步骤(2)中，采用抗凝管采集血液后，72h内进行检测。

为了保证血清的用量，建议血脂高的患者采集两管血液。

[0012]所述步骤(2)中，所得上清液3小时内进行检测。

[0013]所述步骤(2)中，待检测血液样品采用2500-3500r/min的转速分离血清，加入去蛋白剂的血清采用10000-15000rpm的转速获取上清液。

[0014]所述步骤(2)中，血清与去蛋白剂的体积比为1-3:4-6。

[0015]所述步骤(2)中，优选保存温度为2～8℃。

[0016]本发明具有以下优点：
[0017] 1.本发明人通过多次实验和查阅文献，获得了最佳血液采集方式、保存条件及时间、血液提取方法以及液质串联分析参数，有效降低了基质效应的影响。

[0018] 2.本发明方法经验证血清中两性霉素B浓度在10ng/ml-500ng/ml范围内具有很好的线性回归(相关系数R＝0.9999)，准确度高和精密度高，灵敏度高，特异性符合要求。

实际测量结果可知，本发明完全可以满足临床检测两性霉素B的血药浓度的需求。

附图说明
[0019]图1为两性霉素B的标准曲线；
[0020]图2为两性霉素B的色谱图；
[0021]图3为两性霉素B的色谱图。

具体实施方式
[0022]以下通过实施例对本发明作进一步说明，但不构成对本发明的任何限制。

[0023]实验例1采用乙腈和去蛋白剂去除蛋白的效果比较
[0024](1)采用抗凝管采集血液，4℃保存。

取1mL待检测血液样品，3000r/min，离心5min，分离血清。

[0025](2)分别取2份血清，每份200μL，一份加入500μL去蛋白剂去除蛋白，另一份加入500μL乙腈去除蛋白，然后分别15000rpm离心4min，取上清液。

[0026](3)将上清液加入Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪中进行分析。

[0027]色谱条件：色谱柱：Agilent C18柱100×2.1mm，2.6μm；流动相A为0.1％甲酸-5mM 甲酸胺，流动相B为乙腈，采用的梯度洗脱程序为0～0.5min，A.90％，B.10％；0.5～3.5min，A.90％→10％，B.10％→90％；3.5～8min，A.10％，B.90％；后运行时间1.5min；流速0.4mL/ min；柱温40℃；进样量10μL。

质谱条件：离子源ESI，正离子模式下以MRM进行扫描，干燥气温度100℃，雾化器压力25psi，鞘气温度150℃，鞘气流速12L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，两性霉素B选择离子对母离子为m/z924.4，子离子为m/z328.9，m/z312.8，m/ z110.9，碰撞能量均为70V，裂解电压为60V，驻留时间均为100ms。

[0028]两份样品上样分析结果显示去蛋白剂去除蛋白的效果比乙腈更好。

[0029]实验例2采用乙腈和去蛋白剂去除蛋白后的回收率比较
[0030](1)精密称取10mg两性霉素B，置于10mL容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，制成1mg/mL对照储备液。

量取0.1mL对照储备液，置于10mL容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，制成10μg/mL对照中间液。

量取1mL对照中间液，置于10mL容量瓶中，加入空白血液稀释至刻度，配制成1μg/mL含对照的血液。

[0031](2)将1mL含对照的血液3000r/min离心5min，分离出1μg/ml血清。

分别取出2份血清，每份200μL，一份加入500μL去蛋白剂去除蛋白，另一份加入500μL乙腈去除蛋白。

15000rpm离心5min，取上清液。

将浓度为0.286μg/mL的上清液分别取10μL加入Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪中进行分析，分析参数同对比例1。

[0032](3)量取对照中间液2.86mL，置于100mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配成0.286μg/mL对照液，并分别以去蛋白剂和乙腈去蛋白后的上清液的检测结果对比，得到其回收率。

[0033]结果显示，乙腈净化方式的回收率为109％，去蛋白剂净化方式的回收率为95.6％，采用去蛋白剂去除蛋白的效果更好。

[0034]实验例3采用滤膜和高速离心分离上清液的效果比较
[0035](1)将1mL空白血液3000r/min离心5min，分离血清。

取200μL血清，加入500μL去蛋白剂去除蛋白，15000rpm离心5min，取上清液作为基质溶液。

[0036](2)精密称取10mg两性霉素B，置于10mL容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，制成1mg/mL对照储备液。

量取0.1mL对照备液，置于50mL容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，制成2μg/mL对照中间液。

量取200μL对照中间液，加入200μL基质溶液，配制成1μg/mL含对照的基质溶液。

[0037](3)分别取两份含对照的基质溶液，每份200μL，一份采用0.22μm尼龙滤膜进行过滤，另一份15000rpm高速离心5min，取上清液。

[0038](4)分别将10μL上清液加入Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪中进行分析，分析参数同对比例1。

[0039]结果显示，滤膜有明显吸附，故高速离心的净化效果更佳，基质效应为98.7％。

[0040]实验例4不同血液采样方式下的回收率比较
[0041](1)分别采用抗凝管和不含抗凝剂的采血管各采集一管空白血液。

不含抗凝剂的采血管采集的血液取1mL3000r/min离心5min，分离血清。

[0042](2)精密称取10mg两性霉素B，置于10mL容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，制成1mg/mL对照储备液。

量取0.1mL对照储备液，置于10mL容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，制成10μg/mL对照中间液。

量取对照中间液1mL，置于10mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配成1μg/mL对照液。

[0043](3)量取1mL对照中间液，置于10mL容量瓶中，加入不含抗凝剂的血液分离出的血清稀释至刻度，配制成两性霉素B浓度为1μg/mL的血清；量取1mL对照中间液，置于10mL容量瓶中，加入抗凝管采集的血液稀释至刻度，配制成两性霉素B浓度为1μg/mL的血液。

[0044](4)分别取浓度为1μg/mL的血液和血清200μL，加入500μL去蛋白剂去除蛋白，15000rpm离心5min，取上清液。

[0045](5)分别将两组上清液取10μL加入Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent6470
三重四极杆质谱联用仪中进行分析，分析参数同对比例1。

两组上清液检测出的含量与两性霉素B浓度同为1μg/mL的对照液相比较，得出两组上清液的回收率。

[0046]结果如表1，表明药物主要在血清中，且药物未与抗凝剂发生反应而影响药物的回收率。

因此，采用抗凝管采集血液，以血清去蛋白后上样分析效果更好。

为了保证检测过程中血清的用量，血脂高的患者需要多采集一管血液。

[0047]表1不同血液采样方式下的回收率比较
[0048]
含抗凝剂-全血不含抗凝剂-血清
101.1％98.9％
[0049]实验例5血液采集后的保存温度及保存时间对回收率的影响
[0050](1)采用抗凝管采集一管空白血液，配制成两性霉素B浓度为1μg/mL的血液，并配制1μg/mL对照液，方法同对比例4，此处不再赘述。

[0051](2)将上述浓度为1μg/mL的血液分为两组，每组8个样品，每个样品为200μL。

将两组血液分别置于家用冰箱冷冻室0℃以下和冷藏室4℃保存，于2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h、72h依次取出两组温度保存下的样品各一份，解冻。

[0052](3)解冻后将两份样品3000r/min离心5min，分离血清。

各加入500μL去蛋白剂去除蛋白，15000rpm离心5min，取上清液。

[0053](4)将两份上清液分别取10μL加入Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent6470三重四极杆质谱联用仪中进行分析，分析参数同对比例1。

[0054]将检测出的两份上清液中两性霉素B含量分别与对照液的含量相比较，得出其回收率。

结果如图2所示，比较保存温度和保存时间不同的样品的回收率，可以看出血液于家用冰箱冷冻室0℃以下或2-8℃保存72小时以内，检测时两性霉素B含量均稳定。

[0055]表2血液采集后的保存温度及保存时间对回收率的影响
[0056]
[0057]
[0058]实验例6提取后上清液放置时间对回收率的影响
[0059](1)采用抗凝管采集一管空白血液，配制成两性霉素B浓度为1μg/mL的血液，方法同对比例4，此处不再赘述。

[0060](2)将上述浓度为1μg/mL的血液分为5份，每份200μL。

分别于1h、2h、3h、4h、5h取出一份样品，3000r/min离心5min，分离血清，加入500μL去蛋白剂去除蛋白，15000rpm离心5min，取上清液。

并同时配制的1μg/mL对照液，配制方法同对比例4。

[0061](3)将上清液取10μL加入Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪中进行分析，分析参数同对比例1。

[0062](4)将检测出的上清液中两性霉素B的含量与该时段即时配制的1μg/mL对照液相比，得到该上清液的回收率。

[0063]结果表明，提取净化后，放置超过5h，响应下降5％以上。

为了保证定量准确，血液需要在净化后3h内检测。

回收率见表3。

[0064]表3提取后上清液放置时间对回收率的影响
[0065]
1h2h3h4h5h
回收率％101.197.296.295.293.1 [0066]实施例1
[0067]一种液质联用检测血液中两性霉素B含量的方法，包括如下步骤：
[0068](1)标准溶液制备：精密称取两性霉素B标准品10mg，将标准品10mg置于10ml容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，制成1mg/mL标准品储备液。

量取0.1mL标准品储备液，置于100mL容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，制成1μg/ml标准中间液。

量取1mL，2mL，5mL，1mL和5mL标准中间液，分别置于100mL，100mL，100mL，10mL和10mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成浓度分别为10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL的标准工作液。

[0069](2)绘制标准曲线：采用Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪对标准工作液分别定量进样，得到相应的色谱峰。

绘制峰高对组分含量的标准曲线图并得到定量校正方程y＝67.391800x+33.273717，根据信号噪音比得到检出限，10ng/mL标准工作液的信号噪音比为5.3，对照液为水。

标准曲线(见图1)表明，两性霉素B在10ng/ml-500ng/ml有很好的线性回归，相关系数R＝0.99649281。

检出限见图2，两性霉素B 的保留时间见图3。

[0070]色谱条件：色谱柱：Agilent C18柱100×2.1mm，2.6μm；流动相A为0.1％甲酸-5mM 甲酸胺，流动相B为乙腈，采用的梯度洗脱程序为0～0.5min，A.90％，B.10％；0.5～3.5min，A.90％→10％，B.10％→90％；3.5～8min，A.10％，B.90％；后运行时间1.5min；流速0.4mL/ min；柱温40℃；进样量10μL。

[0071]质谱条件：离子源ESI，正离子模式下以MRM进行扫描，干燥气温度100℃，雾化器压力25psi，鞘气温度150℃，鞘气流速12L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，两性霉素B 选择离子对母离子为m/z924.4，子离子为m/z328.9，m/z312.8，m/z110.9，碰撞能量均为70V，裂解电压为60V，驻留时间均为100ms。

[0072](3)血液样品预处理：采用抗凝管采集一管血液，4℃保存2小时，取1mL待检测血液样品，3000r/min，离心5min，分离血清，取血清200μL，加入500μL去蛋白剂去除蛋白，15000rpm离心5min，取上清液备检。

[0073](4)取上清液采用Agilent 1290超高液相色谱串联Agilent 6470三重四极杆质谱联用仪进行上样，将色谱图上测得的峰高代入标准曲线，获得其两性霉素B含量，液相色谱串联质谱分析同步骤(2)。

表4为10个病例血液中两性霉素B含量的检测结果，每个病例进行平行2次平行检测。

结果显示，每个病例的精密度RAD均小于等于2％，达到了药品检测的精密度要求。

[0074]表4病例的血液中两性霉素B含量的检测结果
[0075]
样1(μg/mL)样2(μg/mL)RAD(％)
病例150.551.30.8
病例2109.2108.70.3
病例398.798.70.1
病例4279.3278.80.1
病例560.860.50.3
病例6268.3267.60.2
病例7168.9168.60.1
病例8240.3238.90.3
病例949.747.8 2.0
病例1070.271.9 1.2
图1
图2
图3。