RNA提取及常见失败原因

准备工作
RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。 此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活， 但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭 菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须 戴手套。 2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造 商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基 本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标 明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不 必再处理。
用DEPC处理。
实验步骤如下：
1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器 打匀(Trizol 先放于冰上)。 2. 将匀浆室温放置5 min。 3. 加入200 μ l 氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3 min。 4. 12000 rpm，4℃ 离心15 min。 5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取400 μ l ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀， 室温下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中 间层物质，宁缺勿烂。）
处理的步骤如下：
在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度 为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳 酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）
将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中， 注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶 液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。 将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸 汽灭菌至少30分钟。
灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。
（2） 玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。
DEPC(二乙基焦碳酸酯)
DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组
氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。 试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度, 然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存 的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。 但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而 是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280 值会较高。 A260/A280<1.65 B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相。 E．最后得到的RNA沉淀未完全或冷冻 B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃， 未在-60－-70℃保存。 C．细胞在胰酶处理时被破坏。 D．溶液或离心管未经RNase去除处理。
13. RNA检测 (1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μ g/ ml RNA计算RNA的产量。 OD260/OD280在1.8-2.0 。 (2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定 RNA的完整性和污染情况。
28S— 18S— 5S—
低得率
A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解
6. 12000 rpm， 4℃ 离心15 min 。 7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
8. 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入 700 μ l乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是 不溶解的）
9. 8000 rpm，室温离心10min。 10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。 11. 真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全 挥发掉。 12. 沉淀用30 μ l DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶， 68 ℃处理10 min。
在玻璃烧杯中注入去离子水sw加入depc使其终浓度为00501depchdepc二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物须在通风橱中小心使用将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中注入depcho使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中在摇床上37摇1824小时处理过夜
RNA提取及常见失败原因
目的
研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞 中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RTPCR、cDNA 库构建和Northern Blot等分子生物学 实验的成败。
主要试剂
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰 酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出 的核酸酶。
1. Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。 2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉， 注意配带手套，样品尽可能盖严； 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后 得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细 胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。 在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过 程中释放的内源RNase降解了RNA。 4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入 Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使 细胞裂解充分。 2-8℃ 避光保存一年。