基 因 操 作

人工载体。 Cosmid只含有λ噬菌体的复制起点，
抗性标记(来自质粒)以及cos粘u
粘粒（cosmid）
粘粒是将质粒和λ噬菌体改建的一种
人工载体。
可环化，不会裂解宿主细胞（λphage）
可自我复制（plasmid）
45 kb外源DNA
可与同源序列质粒重组
插入型 & 置换型 克隆载体 & 表达载体
质粒（plasmid）
质粒是存在于许多细菌中，独立于 染色体外的双链闭合环状DNA分子。
质粒（plasmid）
SacⅠ EcoRⅠ SmaⅠ KpnⅠ XbaⅠ SalⅠ PstⅠ HindⅢ SphⅠ
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
插入片段大小 0~10 kb 0~10 kb 9~23 kb 33~44 kb 70~100 kb 130~150 kb 300 kb 0.2~2.0 Mb
细胞克隆（Cell clone）
重组DNA克隆的分离
Amp
蓝白筛选
重组DNA克隆的分离
SacⅠ EcoRⅠ SmaⅠ KpnⅠ XbaⅠ SalⅠ PstⅠ HindⅢ SphⅠ

Denaturing step: 90℃~95℃
Annealing step: 50℃~68℃
Extension step: 70℃~72℃
Optimal temperature for Taq polymerase to attach to and extend the new strand of DNA
聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（Polymerase Chain
Reaction，PCR），是一种在体外(in vitro)
短时间内大量、迅速的选择扩增特定的靶
DNA序列的核酸扩增方法。
1971, Dr. Kjell Kleppe 1983, Dr. Mullis
聚合酶链式反应（PCR）
95℃ 72℃ 55℃
聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（PCR）
优点
迅速 灵敏 稳定
聚合酶链式反应（PCR）
缺点
需要靶序列的信息
PCR产物长度有限
DNA复制的不确定性
本章节重点

重组DNA技术 分子杂交技术 PCR技术及应用
粘粒（cosmid）
pJB8 5.4 kb
Sal Ⅰ
大片段DNA克隆载体

P1噬菌体 & PAC


BAC, 细菌人工染色体
YAC, 酵母人工染色体

着丝粒


端粒
自主复制元件，ARS
运载体（Vector）
载体
Plasmid Insertion λ vector Replacement λ vector Cosmid P1 phage PAC BAC YAC
分子杂交
同源双链（homoduplex）
异源双链（heteroduplex）
探针的制备与应用
探针(probe)：分子杂交检测其互补序列 的标记DNA或RNA序列，能在许多 DNA或RNA序列的复杂混合物中识 别所需克隆的分子。

寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)

探针的标记及方法

同位素标记

32P，35S，3H

非同位素标记
地高辛
生物素
探针的标记及方法


缺口平移法(nick translation)
随机引物延伸法(random-primed labeling)


末端标记法(end labelling)
PCR标记法(PCR amplification)
CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
分子杂交

点印迹 （dot-blot）法
Southern印迹（Southern blot）
Southern Blot
-
+
Southern Blot
镰状细胞贫血(HbS)： 第5～7位密码子
MstⅡ: CCTNAGG
A: CCTGAGGAG S: CCTGTGGAG
A A A S S S
1.40 Kb 1.20 Kb
1.2 Kb
0.2Kb
0.20 Kb
分子杂交

点印迹 （dot-blot）法
Southern印迹（Southern blot） Northern印迹（Northern blot） Western印迹（Western blot） 免疫印迹（immunoblotting）
TypeⅡ TypeⅢ

限制性内切核酸酶
限制酶：能够识别DNA链的特定部位 并能进行切割。
EcoRⅠ
菌株名 种名 属名
酶的序号
限制性内切核酸酶
HaeⅢ
5’ 3’ 5’ 3’
G G C C C C G G
G A T C C T A G
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
重组DNA

构建
转化 扩增（克隆） 分离和检测
foreign DNA
bacterial cell vector restriction endonuclease ligase
重组DNA技术流程简图
host
限制性内切核酸酶
限制酶：能够识别DNA链的特定部位 并能进行切割。


TypeⅠ
医学遗传学
基因操作
本章节重点

重组DNA技术 分子杂交技术 PCR技术及应用
重组DNA
重 组 DNA 技 术 （ recombination DNA technique）指将目的DNA片段或人工合成的 基因，通过载体在体外重组、转移并插入到另
一种生物的基因组中，使其表达为新的性状或
用于进一步的研究，是基因操作的核心技术。 包括DNA克隆（DNA cloning）和分子杂交 （molecular hybridization）。
简并探针(degenerate probe)
探针的制备与应用
简并探针（degenerate probe）
Leu
T C CT A G
Cys
TG C
T
Ile
T AT C A
Tyr
T
Met
His
T
Gln Asp
A T
Ser
T C TC A G
TA C ATG CA C CA G GAC
TT G
A
AGC
BamHⅠ
LacZ pUC19 2686 bp
Ori
ApR
λ噬菌体（Lambda phage）
λ噬菌体是一种可在体外包装的细胞 病毒，能高效感染细菌细胞并在其中克 隆中等长度的DNA片段的载体。
Cos site 裂解 & 溶源
λ噬菌体置换载体
λ噬菌体插入载体
粘粒（cosmid）
粘粒是将质粒和λ噬菌体改建的一种
T
探针的制备与应用
探针(probe)：分子杂交检测其互补序列 的标记DNA或RNA序列，能在许多 DNA或RNA序列的复杂混合物中识 别所需克隆的分子。

寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)

简并探针(degenerate probe) 单一EST探针(unique EST-base probe)
Mullis F
"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
The Nobel Prize in Chemistry 1993
聚合酶链式反应（PCR）

Denaturing step: 90℃~95℃
Denatures the double stranded DNA into single strands
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
BamHⅠ
LacZ
pUC19 2686 bp
ApR
Ori
重组DNA克隆的分离
Amp
Ampm）
His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala
His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala CAT CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC
CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
ASO杂交
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT
限制性内切核酸酶
进行DNA重组，需要载体DNA和 外源DNA具有相同序列的粘性末端。
相同的限制酶 识别相同靶序列的不同限制酶 识别不同序列，但能产生一致粘
性末端的限制酶
DNA连接酶
一种封闭DNA链上缺口的酶，借
助ATP水解提供的能量催化DNA链的5’
-PO4 与另一DNA链的3’-OH生成磷酸
95℃ 72℃ 55℃
聚合酶链式反应（PCR）

Denaturing step: 90℃~95℃
Annealing step: 50℃~68℃
Allows the primers to attach to complementary strand of DNA
95℃ 72℃ 55℃
聚合酶链式反应（PCR）
G G C C
C C G G
3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
MboⅠ
G A T C C T A G G G A T C C C C T A G G
5’ BamHⅠ 3’
PstⅠ
G G A T C C C C T A G G C T G C A G G A C G T C
5’ 3’
C T G C A G G A C G T C
分子杂交

点印迹 （dot-blot）法
dot and slot hybridization allele-specific oligonucleotide, ASO
ASO杂交
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT
CAT CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC
二酯键。
E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
运载体（Vector）
运载体是能将外源目的DNA导入受 体细胞，并可自我复制和增殖的工具。
分子量小。
有多种限制酶切位点。 有可供选择的标记基因或报道基因。 克隆载体有复制起点，表达载体有启
动子。
运载体（Vector）
运载体是能将外源目的DNA导入受 体细胞，并可自我复制和增殖的工具。