ITS测序.
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（3）取上清加入0.6倍体积异丙醇，室温下静置15min；沉 淀核酸
（4）4℃,10000g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次， 无水乙醇洗一次，真空干燥5min；
（5）将沉淀溶解在200μL pH8.0 TE Buffer中。 注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4℃保存。
二、PCR加样体系
真菌DNA模版 10×buffer MgCl2（25mM） dNTP（各2.5mM） 上游引物ITS1 （10μM） 下游引物ITS4 （10μM） rTaq酶（5U/μL） ddH2O 总体积
利用ITS序列鉴定未知真菌
温永芳 2015.6.12
1：ITS鉴定原理 2：PCR原理 3：电泳原理 4：具体操作
目录
形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等
微生物鉴定 分子鉴定
细菌：16s rDNA 真菌：ITS序列
生理生化
一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS
二、PCR原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶 链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、 延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子 链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在 体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序 列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方 面。
电泳仪器和试剂
电泳仪、电泳槽、灌胶模具等 琼脂糖、TEVቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ冲液、样品缓冲液
一、真菌基因组DNA提取
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并 使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
CTAB提取缓冲液：2%W/V CTAB;100mM Tris-Cl pH 8.0;20mM EDTA, pH 8.0; 1.4M NaCl
DNA提取操作步骤
（1）取真菌菌丝0.2g，用液氮研磨充分，装入含有0.5mL预 热的CTAB提取缓冲液的1.5mL离心管中,迅速混匀,在65℃ 水浴中保温1h,期间不定时摇匀；
（2）放置室温，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(V/V: 25∶24∶1) 轻柔混匀，4℃、7500g离心10min；抽提去蛋白
2μL 2.5μL 2μL 2μL 1μL 1μL 0.3μL 14.2μL 25μL
PCR反应条件
94℃预变性4min； 94℃变性1min
50℃退火1min 72℃延伸1min 72℃总延伸10min； 10 ℃保温。
32个循环
三、琼脂糖凝胶电泳
1.凝胶制备 制备1.0%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加 入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至 50-60℃ 时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10µl DNA样液与 2µl 上样 buffeer 混匀， 用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压 为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚 兰移动到一定位置，停止电泳。 4.EB染色 5.观察拍照
481 TGTCACATGC TCTGTAGGAT TGGCCGGCGC CTGCCGACGT TTTCCAACCA TTTTTTCCAG
541 GTTGACCTCG GATCAGGTAG GGATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA
登陆Genbank blast在线比对
PCR的基本原理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
子链延伸 DNA加倍
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
三、琼脂糖凝胶电泳原理
DNA分子在高于 等电点的PH溶液中带 负电荷，在电场中向 正极移动。在一定电 场强度下，DNA分子 的迁移速度与相对分 子质量的对数成反比。
序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真 菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法
ITS序列利用真菌rDNA上的5.8s，18s和 28srDNA序列之间的转录间隔5.8s，18s和 28srDNA序列进化上高度保守，而ITS序列由 于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多 数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对 一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定 以及系统发育分析。
序列比对分析
谢谢！
鉴定步骤包括：
* 提取微生物样品DNA * 扩增出真菌ITS区序列 * DNA测序，将样品序列与GenBank中已知序列 进行比对 * 判定微生物种类，可将微生物划分到属或种 * 与同源性较高菌种构建系统发育树
实验材料
在PDA上培养七天的未知真菌一株
①离心机 ②水浴锅 ③研钵 ④微量移液器
仪器用具
泳道1：DL2000 泳道2：PCR产物
ITS测序结果
1
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CCGAGTGCGG GTCCTTTGGG CCCAACCTCC
61 CATCCGTGTC TATTATACCC TGTTGCTTCG GCGGGCCCGC CGCTTGTCGG CCGCCGGGGG
121 GGCGCCTTTG CCCCCCGGGC CCGTGCCCGC CGGAGACCCC AACACGAACA CTGTCTGAAA
181 GCGTGCAGTC TGAGTTGATT GAATGCAATC AGTTAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG
241 TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG
its序列一itsinternaltranscribedspacer鉴定是指对its序列进行dna测序通过将测序得到的its序列与已知真菌its序列比较从而获得未知真菌种属信息的一种方法its序列利用真菌rdna上的58s18s和28srdna序列之间的转录间隔58s18s和28srdna序列进化上高度保守而its序列由于选择压力小在自然中变异较快在绝大多数真菌中表现出序列多态性表现为种内相对一致种间差异比较明显非常适合真菌鉴定以及系统发育分析
301 TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT
361 CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCCCGGC TTGTGTGTTG GGTCGCCGTC CCCCTCTCCG
421 GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGCGTCCGA TCCTCGAGCG TATGGGGCTT
（4）4℃,10000g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次， 无水乙醇洗一次，真空干燥5min；
（5）将沉淀溶解在200μL pH8.0 TE Buffer中。 注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4℃保存。
二、PCR加样体系
真菌DNA模版 10×buffer MgCl2（25mM） dNTP（各2.5mM） 上游引物ITS1 （10μM） 下游引物ITS4 （10μM） rTaq酶（5U/μL） ddH2O 总体积
利用ITS序列鉴定未知真菌
温永芳 2015.6.12
1：ITS鉴定原理 2：PCR原理 3：电泳原理 4：具体操作
目录
形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等
微生物鉴定 分子鉴定
细菌：16s rDNA 真菌：ITS序列
生理生化
一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS
二、PCR原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶 链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、 延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子 链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在 体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序 列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方 面。
电泳仪器和试剂
电泳仪、电泳槽、灌胶模具等 琼脂糖、TEVቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ冲液、样品缓冲液
一、真菌基因组DNA提取
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并 使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
CTAB提取缓冲液：2%W/V CTAB;100mM Tris-Cl pH 8.0;20mM EDTA, pH 8.0; 1.4M NaCl
DNA提取操作步骤
（1）取真菌菌丝0.2g，用液氮研磨充分，装入含有0.5mL预 热的CTAB提取缓冲液的1.5mL离心管中,迅速混匀,在65℃ 水浴中保温1h,期间不定时摇匀；
（2）放置室温，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(V/V: 25∶24∶1) 轻柔混匀，4℃、7500g离心10min；抽提去蛋白
2μL 2.5μL 2μL 2μL 1μL 1μL 0.3μL 14.2μL 25μL
PCR反应条件
94℃预变性4min； 94℃变性1min
50℃退火1min 72℃延伸1min 72℃总延伸10min； 10 ℃保温。
32个循环
三、琼脂糖凝胶电泳
1.凝胶制备 制备1.0%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加 入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至 50-60℃ 时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10µl DNA样液与 2µl 上样 buffeer 混匀， 用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压 为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚 兰移动到一定位置，停止电泳。 4.EB染色 5.观察拍照
481 TGTCACATGC TCTGTAGGAT TGGCCGGCGC CTGCCGACGT TTTCCAACCA TTTTTTCCAG
541 GTTGACCTCG GATCAGGTAG GGATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA
登陆Genbank blast在线比对
PCR的基本原理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
子链延伸 DNA加倍
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
三、琼脂糖凝胶电泳原理
DNA分子在高于 等电点的PH溶液中带 负电荷，在电场中向 正极移动。在一定电 场强度下，DNA分子 的迁移速度与相对分 子质量的对数成反比。
序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真 菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法
ITS序列利用真菌rDNA上的5.8s，18s和 28srDNA序列之间的转录间隔5.8s，18s和 28srDNA序列进化上高度保守，而ITS序列由 于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多 数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对 一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定 以及系统发育分析。
序列比对分析
谢谢！
鉴定步骤包括：
* 提取微生物样品DNA * 扩增出真菌ITS区序列 * DNA测序，将样品序列与GenBank中已知序列 进行比对 * 判定微生物种类，可将微生物划分到属或种 * 与同源性较高菌种构建系统发育树
实验材料
在PDA上培养七天的未知真菌一株
①离心机 ②水浴锅 ③研钵 ④微量移液器
仪器用具
泳道1：DL2000 泳道2：PCR产物
ITS测序结果
1
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CCGAGTGCGG GTCCTTTGGG CCCAACCTCC
61 CATCCGTGTC TATTATACCC TGTTGCTTCG GCGGGCCCGC CGCTTGTCGG CCGCCGGGGG
121 GGCGCCTTTG CCCCCCGGGC CCGTGCCCGC CGGAGACCCC AACACGAACA CTGTCTGAAA
181 GCGTGCAGTC TGAGTTGATT GAATGCAATC AGTTAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG
241 TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG
its序列一itsinternaltranscribedspacer鉴定是指对its序列进行dna测序通过将测序得到的its序列与已知真菌its序列比较从而获得未知真菌种属信息的一种方法its序列利用真菌rdna上的58s18s和28srdna序列之间的转录间隔58s18s和28srdna序列进化上高度保守而its序列由于选择压力小在自然中变异较快在绝大多数真菌中表现出序列多态性表现为种内相对一致种间差异比较明显非常适合真菌鉴定以及系统发育分析
301 TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT
361 CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCCCGGC TTGTGTGTTG GGTCGCCGTC CCCCTCTCCG
421 GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGCGTCCGA TCCTCGAGCG TATGGGGCTT