碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定

碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定
刘庆堂;王磊;职爱民;滕蔓;胡骁飞;孙亚宁;宋春美;王寅彪;张改平
【摘要】合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清.采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO - BSA和检测抗原AMO - OVA,经紫外分光光度法和SDS -PAGE以及动物免疫进行鉴定.结果表明,偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移,AMO - BSA 在276 nm处出现最大吸收峰,BSA的泳动速度大于AMO - BSA.免疫后获得的3只小鼠多抗血清,通过间接竞争ELISA测定,效价可达1×10-4以上,1号小鼠半数抑制浓度(IC50)为573.75 ng/mL,敏感性较好.AMO完全人工抗原的合成以及鼠源多克隆抗体血清的制备,为AMO单克隆抗体的制备奠定了基础.%To synthesize the artificial antigen of AMO and obtain its mouse polyclonal antiserum, the immunogen AMO-BSA and coating antigen AMO-OVA were synthesized using EDC method and identified by ultraviolet scanning and SDS-PAGE. BALB/c mice were immunized with the synthesized antigens and the polyclonal antiserum was determined by indirect and blocking ELISA. The results showed that after conjugation, the ultraviolet absorption peak of AMO-BSA appeared at 276 nm, indicating that certain displacement occurred comparing with the ultraviolet absorption peaks of both AMO and BSA. The electropharetic mobility of BSA was observed bigger than that of AMO-BSA. Indirect ELISA showed that the antiserum titres of all the three immunized BALB/c mice were above 1 X 10~4. With the IC50 of 573.
75 ng/mL,No, 1 mouse polyclonal antiserum showed the best sensitivity. In
this study, AMO-BSA and AMO-OVA were successfully synthesized and high sensitive polyclonal antiserums against AMO were prepared,which provides a basis for the preparation of monoclonal antibodies against AMO.
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2012(041)003
【总页数】4页(P142-145)
【关键词】阿莫西林;人工抗原;合成;多克隆抗体;碳二亚胺法
【作者】刘庆堂;王磊;职爱民;滕蔓;胡骁飞;孙亚宁;宋春美;王寅彪;张改平
【作者单位】河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;江南大学食品学院,江苏无锡214122;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
阿莫西林（amoxycillin，AMO）属于B－内酰胺类抗生素。

B－内酰胺类抗生素对革兰氏阳性、阴性菌有较强的抑制作用，具有高效、广谱、低毒的特点，是当前临床上应用最多的一类抗菌药物之一［1］，也广泛应用于兽医临床方面。

但因其易在畜禽体内蓄积，会导致细菌产生抗药性等副作用，人如果食用这些抗生素超标的动物源食品后，可造成过敏反应，甚至致畸、致癌。

世界各国均制定了针对AMO的残留标准，中国和欧盟要求在动物肌肉、肝、肾、脂肪中阿莫西林的最高限量为0.05mg／kg；美国要求更低，为0.01mg／kg［2］。

目前，关于 AMO 残留检测分析的方法，主要是高效液相色谱法（HPLC）［3－5］、高效毛细管电泳法（HPMC）［6－7］、微生物学方法（SST）［8］和液相色谱－质谱联用分析法（LC－MS）［9］。

但是，SST存在假阳性几率，HPLC与LC－MS 方法通常需要多个液－液分离和浓缩步骤，操作复杂，仪器设备要求高，不便于临时大规模筛查自检。

免疫学检测方法具有高通量、高敏感、简便的优点，在小分子抗原检测中有非常广阔的前景。

抗体是免疫学检测不可或缺的生物性原材料，人工抗原是抗体制备的前提，也是技术难点和关键点。

鉴于此，用碳二亚胺法（EDC）制备了阿莫西林人工抗原并对其进行鉴定，旨在为AMO单克隆抗体的制备以及AMO胶体金免疫试剂的研制奠定基础。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 溶液 0.01mol／L磷酸盐缓冲液（PBS），pH值7.4；洗涤缓冲液（PBS＋0.5mL／L Tween 20，PBST）；0.05mol／L的 NaHCO3／Na2CO3 缓冲液
（CBS）；pH 值为9.6的酶底物缓冲液；TMB磷酸－柠檬酸缓冲液；终止液为
2mol／L的H2SO4。

1.1.2 试剂阿莫西林，纯度≥98.0%；乙基－N，N－二甲基丙基碳二亚胺（EDC），Sigma公司产品；N，N′－二环己基碳二亚胺（DCC），吉尔生化
（上海）有限公司产品；牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA），弗氏完
全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）均为 Gibco公司产品；羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG－HRP）为华美生物工程有限公司产品；其他常规试剂为国产，AR级。

1.1.3 仪器 U－3000紫外扫描仪（UV），日本岛津公司生产；DU－600核酸蛋
白分析仪，德国BECKMAN公司生产；Bio－Rad－550型酶标仪，美国 Bio－Rad公司生产；AE260电子天平，德国 METTLER公司生产；3K－18高速冷冻离心机，德国Sigma公司生产；凝胶成像系统及分析软件，Syngene公司生产；HI 9321酸度计，美国HANNA公司生产；超纯水仪，Millipore公司产品；JM－250电泳仪，大连捷迈科贸有限公司生产；DK－8D电热恒温水槽，上海一恒科
技有限公司生产。

1.1.4 试验动物 SPF级雌性8周龄BALB／c小鼠，购自郑州大学医学院实验动物
中心，由农业部动物免疫学重点开放实验室饲养。

1.2 方法
1.2.1 人工抗原的合成称取10mg的AMO溶解于500μL四氢呋喃中，加入
5.6mg NHS和15 mg EDC，室温避光反应24h，10 000r／min离心15 min，弃沉淀，干燥上清，残留物溶于200μL二甲基亚砜中，得到活化产物AMO反应液。

称取BSA 5 mg，充分溶解于5mL 0.13mol／L的 NaHCO3 溶液中，然后将AMO活化反应液缓慢逐滴加入BSA溶液中，密封避光于室温下搅拌4h，反应产物置于4℃层析柜中，用0.01mol／L的PBS透析72h，离心去沉淀，得到免疫
抗原AMO－BSA，分装，－20℃条件下保存备用。

合成技术路线见图1。

检测抗
原AMO－OVA的制备方法和AMO－BSA相同。

1.2.2 半抗原的紫外扫描鉴定偶联后的AMOBSA和AMO－OVA溶液，用紫外分光光度计测定其蛋白质的质量浓度和特征峰。

分别配制AMO、BSA和 OVA 的标准溶液，选择与 AMO－BSA、AMO－OVA溶液的蛋白质质量浓度一致的BSA、OVA标准溶液，于220～340nm范围内进行紫外扫描，得到最大吸收峰及特征值。

1.2.3 SDS－PAGE凝胶电泳鉴定参照文献［10］介绍的方法，配制50mg／L的浓缩胶、100mg／L的分离胶；调节浓缩胶电压为70V，分离胶电压为90 V，各孔上样量20μL，SDS－PAGE后考马斯亮蓝染色5～6h，于脱色液中过夜脱色。

依据蛋白条带位置的差异判断偶联效果。

1.2.4 小鼠多抗血清（pAb）的制备及鉴定
1.2.4.1 动物免疫用 AMO－BSA免疫3只8周龄的BALB／c小鼠，背部皮下
4～6点注射，免疫剂量为50μg／只（0.2mL／只）。

首免用无菌PBS溶解的AMO－BSA，与等体积的FCA混合，充分乳化；加强免疫用无菌PBS溶解的AMO－BSA，与等体积的FIA混合，充分乳化，共免4次，每次间隔2周。

第3
次免疫后10d断尾采血分离血清，3 000r／min离心5min，取上清4℃下保存备用。

图1 EDC法制备AMO-BSA路线
1.2.4.2 小鼠pAb效价的测定采用间接ELISA法测定小鼠多抗血清效价，参照文
献［11］的方法并稍作调整：采用5μg／mL的AMO－BSA包被，每孔50μL，37℃下孵育2h，PBST洗涤6次；用5%的猪血清溶液每孔200μL封闭，37℃下孵育1h，PBST洗涤6次；加稀释后的多抗血清，每孔50μL，用封闭液倍比稀释，设空白对照（BC）和阴性对照（NC），37℃下孵育15min，PBST洗涤6次；加用封闭液稀释1 000倍的GaMIgG－HRP，每孔50μL，37℃下孵育30min，
PBST洗涤6次；加酶底物TMB，每孔50μL，显色反应10min；加入终止液
（2mol／L的 H2SO4），每孔50μL，终止反应，读OD450值。

结果判断：以待测孔OD450值≥NC OD450值的2.1倍（P／N≥2.1），判为阳性。

1.2.4.3 pAb抑制效价的测定采用间接竞争ELISA测定小鼠多抗血清对AMO的
半数抑制浓度（IC50），并以IC50作为敏感度。

其操作步骤与间接ELISA的区别在于，第三步先加入不同质量浓度的AMO溶液各50μL作为抑制剂，除空白和阴性孔外，再加入OD450值最接近1.0的稀释过的小鼠血清各50μL。

2 结果与分析
2.1 人工抗原的鉴定结果
2.1.1 UV鉴定结果利用U－3000紫外扫描仪对AMO、BSA、OVA、AMO－BSA、AMO－OVA 在220～340nm波长范围进行扫描。

由图2可知，BSA在280nm处有吸收峰，AMO在271nm处有吸收峰，AMO－BSA偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移，其在276nm处出现最大吸收峰，初步证明偶联成功。

图2 BSA、AMO和AMO-BSA的紫外扫描光谱
2.1.2 SDS－PAGE鉴定结果由图3可知，AMOBSA的泳动速度小于BSA，表明AMO－BSA的分子量略大于BSA，初步证明偶联成功。

图3 AMO-BSA和BSA的SDS－PAGE结果
2.2 间接ELISA测定pAb效价
间接ELISA检测结果（表1）表明，AMO－BSA免疫的3只小鼠的血清抗体效价均可达到1×10－4以上，其中1号小鼠的血清效价可达到1∶1.28×104，表明用AMO－BSA免疫小鼠获得了较好的免疫效果。

表1 1、2、3号小鼠pAb间接ELISA效价测定结果小鼠序号阴性对照空白对照1 2.753 2.454 2.417 1.948 1.220 0.746 0.437 0.0抗血清稀释倍数200 400 800 1
600 3 200 6 400 12 800 60 0.065 2 2.336 1.930 1.246 0.725 0.447 0.258
0.162 0.064 0.061 3 2.698 2.200 2.141 1.547 0.993 0.585 0.320 0.058 0.053 2.3 pAb的敏感性
由图4可知，1号小鼠多抗血清标准抑制曲线的线性回归方程为y＝－0.254 9x＋1.203 2，相关系数R2＝0.992 1，根据回归方程计算多抗血清对AMO的IC50
为573.75ng／mL，表明本试验所获AMO抗血清对AMO具有较高的敏感性。

图4 1号小鼠的AMO IC50
3 讨论
3.1 AMO抗原偶联方法
AMO是小分子物质，属于半抗原，即只有反应原性，无免疫原性，只有将其与具有免疫性的载体蛋白偶联才能形成完全抗原。

本试验考虑到AMO分子构象中的羧基，用碳二亚胺法和活性酯法，分别直接偶联制备出免疫抗原和检测抗原。

采用单一的制备方法，会引起蛋白交联等反应，2种抗原制备方法的最大优点是可以有效避免载体蛋白自身的氨基和羧基发生交联反应，从而有效减少反应副产物的生成。

3.2 人工抗原的鉴定
鉴定免疫抗原和检测抗原的常用方法有紫外扫描光谱法（UV）、红外色谱（IR）、SDS－PAGE电泳和免疫学鉴定等。

由紫外扫描光谱可知，BSA、OVA 和AMO
的最大吸收波长分别为280nm、280nm和271 nm，而AMO－BSA和AMO－OVA的最大特征吸收波长为276nm，因而可以鉴定偶联成功。

除此之外，从SDS－PAGE 蛋白条带可以看出，AMO－BSA、AMO－OVA与BSA和
OVA明显错开，也能证明偶联成功。

此外，也可以通过计算偶联比来鉴定偶联成
功［12］。

用制备的免疫抗原免疫3只小鼠，均获得良好效价，也更进一步说明
小分子偶联载体蛋白成功。

3.3 pAb效价和敏感性
本研究成功合成了AMO人工抗原AMO－BSA和AMO－OVA，并免疫小鼠，通过间接ELISA和间接竞争ELISA试验证明，AMO－BSA免疫的3只小鼠均产生了针对AMO的特异性抗体，其效价都在1×10－4以上，其中1号小鼠半数抑制浓度为573.75 ng／mL。

本试验获得了高效、敏感、特异的多克隆抗体，为进一步筛选AMO单克隆抗体及建立AMO的免疫学检测体系打下了良好的基础。

参考文献：
［1］Gilbert J C，Jean M.Resistance to antibiotics［J］.Science，1994，264：359.
［2］Wibawa J I D，Fowkes D，Shaw P N，et al.Measurement of amoxicillin in plasma and gastric samples using highperformance liquid chromatography with fluorimetric detection［J］.Journal of Chromatography B，2002，774（2）：141－148.
［3］于桂阳.阿莫西林在牛肉中残留的高效液相色谱检测及分析［J］.食品科学，2008，29（4）：332－334.
［4］张玉廷，刘艳，郑虎哲，等.牛肉中阿莫西林残留量的高效液相色谱分析［J］.分析试验室，2007，26（3）：95－98.
［5］Hermann J M，Christian K.Determination of amoxicillin in human serum and plasma by high－performance liquid chromatography and on－line postcolumn derivatisation［J］.Journal of Chromatography A，1998，812（1／2）：221－226.
［6］王守箐.毛细管区带电泳法快速测定阿莫西林克拉维酸钾片中阿莫西林和克拉维酸钾［J］.理化检验：化学分册，2005，41（8）：595－597.
［7］Hernandez M，Borrull F，Calull M.Determination of amoxicillin in plasma samples by capillary electrophoresis［J］.Journal of
Chromatography B，1999，731（2）：309－315.
［8］崔小军，王硕.牛奶中残留青霉素类抗生素检测方法的研究进展［J］.食品研究与开发，2005，26（4）：113－116.
［9］Holstege D M，Puschner B，Whitehead G，et al.Screening and mass spectral confirmation ofβ－lactam antibiotic residues in milk using LC－MS ／MS［J］.Journal of Agric Food Chemistry，2002，50（2）：406－411. ［10］Sambrook J，Fritsch E，Maniatis T.Molecular cloning：A laboratory manual［M］.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：6－9. ［11］刘宜兵，滕蔓，张改平，等.新霉素单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究［J］.华北农学报，2009，24（4）：80－83.
［12］职爱民，刘庆堂，李青梅，等.西马特罗人抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备［J］.华北农学报，2010，25（4）：97－101.。