小型猪富血小板血浆对牙周膜干细胞的成骨诱导

小型猪富血小板血浆对牙周膜干细胞的成骨诱导
张远;钟良军;张鹏涛;张源明;徐艳
【摘要】背景:组织工程技术为牙周炎致骨组织缺损的修复提供了新的思路.目的:
探寻富血小板血浆在小型猪牙周膜干细胞成骨诱导中的作用.方法:采集贵州小型猪
静脉血,三次离心制备富血小板血浆.采用组织块法分离培养小型猪牙周膜干细胞,分别将含体积分数0.8%,1.0%,1.2%的富血小板血浆与牙周膜干细胞共同培养
3,7,14,21 d,以未添加富血小板血浆的牙周膜干细胞作为对照.结果与结论:体积分数0.8%,1.0%,1.2%的富血小板血浆成骨诱导第14天,碱性磷酸酶活性达到峰值,其中
体积分数1.0%的富血小板血浆诱导的细胞碱性磷酸酶活性最高,第21天时碱性磷
酸酶活性降低.茜素红染色显示富血小板血浆成骨诱导第21天细胞染色呈阳性.单
克隆纯化后细胞的生长曲线从第3天起进入对数生长期,第8天细胞数量达到顶峰.
说明富血小板血浆具有诱导牙周膜干细胞成骨的能力,以体积分数1.0%时诱导成骨效率最优.%BACKGROUND: Tissue engineering technology provides a new way for bone defects caused by periodontit is.OBJECT IVE: To explore the effect of platelet-rich plasma (PRP) on osteogenic induction of miniature
pig periodontal ligamentstem cells (PDLSCs).METHODS: Collected the Guizhou miniature pig's venous blood and prepared the centrrfuged PR P three times; tssueblockmethod was used to culture the periodontal ligament cells. 0.8%, 1.0%, 1.2% concentration of PRP were co-cultured withPDLSCs for 3. 7. 14 and 21 days, respectively. Ho PRP addition as control group.RESULT 3 AND CONCLUSION: Ak aline phos phatase (AKP) actwrly reach a peak at the 14th day after induced wrth 0.8%. 10%and 1.2% PRP. and highest activity of AKP was induced by 1.0% PRP. AKP activity
was reduced at the 21st day.Aizarinredstaining showed the PDLSCs were positive at 21st day after osteogenic induction of PRP. Purified monoclonal cell growth curve entering the logarithmic growth phase since the 3rd day. the amount of cells reached a peak at the 8th day. PRP can induce osteogenic PDLSC performance, especially the 1.0% PRP induction showed the optimal efficiency in vitro.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2012(016)001
【总页数】5页(P125-129)
【关键词】牙周膜干细胞;小型猪;富血小板血浆;成骨诱导;碱性磷酸酶
【作者】张远;钟良军;张鹏涛;张源明;徐艳
【作者单位】新疆医科大学第一附属医院口腔系,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐
市,830011;杭州师范大学临床医学院,浙江省杭州市,310015;新疆医科大学第一附属医院口腔系,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830054;南京医科大学附属口腔医院,江苏省南京市,210029
【正文语种】中文
【中图分类】R394.2
0 引言
随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞的数量和扩增的能力也随之降低，限制了其临
床应用[1]。

寻找其他组织来源的间充质干细胞作为临床治疗的干细胞源成为各学
科关注的焦点。

2004年，Seo等[2]发现牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell, PDLSC)具有多方向诱导分化的能力，这无疑为组织工程修复的种子细
胞来源提供了新的思路。

目前实验室和临床上使用的诱导剂多为体外合成，而富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)的制备来源于患者自体，可以有效避免疾病传染和免疫排斥反应，在研究和临床上有着良好的应用前景。

基于此，实验观察了PRP对PDLSC的成骨诱导作用，并探索了诱导PDLSC成骨的PRP最优浓度。

1 材料和方法
设计：体外对比观察实验。

时间及地点：于2011-04/08在新疆医科大学第一附属医院实验研究中心干细胞
实验室完成。

材料：
实验动物：健康4月龄贵州小型猪4头，雄性，体质量15 kg左右，由成都硕达
生物科技有限公司提供(CL级)，许可证号：SCXK(川)2008-24。

试剂和仪器：
试剂及仪器来源DMEM低糖培养基、胎牛血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)试剂盒血小板衍化生长因子AB(platelet-derived growth factor-AB, PDGF-AB)ELISA试剂盒、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)ELISA 试剂盒鼠抗人基质细胞抗原1(stromal cell antigen-1，STRO-1)单克隆抗体山羊抗小鼠IgM-FITC荧光二抗牛凝血酶、CaCl2 DMI400B
正置、倒置相差显微镜CO2培养箱酶联免疫检测仪美国Hylone公司南京建成生
物工程研究所上海西唐生物科技公司RD公司，美国Santa Cruz公司，美国
Sigma公司，美国Leica，德国Heal Force，香港Bio-Rad 公司，美国
实验方法：
PRP的提取：无菌采集贵州小型猪静脉血45 mL，加入含5 mL、38 g/L枸橼酸
钠抗凝剂的50 mL离心管中，4 ℃、200 g离心5 min，轻柔吸取上层血浆层、
中层白膜层和下层与中层交接约1 cm的红细胞层；4 ℃、200 g离心5 min，轻柔吸取上层血浆和交界面下少量的红细胞；4 ℃、800 g离心10 min后，轻轻吸弃上清液，留底液约5 mL，轻柔重悬，取样20 μL经血小板稀释液稀释后进行血小板计数，同时取样20 μL涂片，备用。

PRP的激活：将含1 000 U/mL牛凝血酶的体积分数10%CaCl2溶液按1∶10加入PRP中，4 ℃过夜。

次日PRP悬液凝结为胶冻状，4 ℃，1 000 g离心10 min，收集上清液，配制含体积分数10%PRP上清液的DMEM溶液，0.22 μm滤器过
滤除菌，分装入1.5 mL EP管，-20 ℃冻存备用。

临用前在4 ℃下解冻。

瑞氏染色：取PRP提取液的涂片，充分干燥后滴加瑞氏染液，室温静置15 min 后，蒸馏水冲去染液，晾干，显微镜下观察。

PDGF-AB和TGF-β1水平的测定：取-20 ℃冻存的体积分数10%PRP在4 ℃下
解冻，按ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm处测量吸光度值。

PDLSC的原代和传代培养：全麻下拔除小型猪上颌尖牙，用含10 000 U/mL青/
链霉素的PBS反复冲洗2遍后，无菌PBS再次冲洗2遍，收集根中1/3牙周膜组织，均匀剪碎，按组织块法，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养
液置入37 ℃、体积分数5%CO2孵箱培养。

细胞汇合达80%左右，用胰蛋白酶
消化后传代。

有限稀释法分离纯化PDLSC：取第1代对数生长的细胞消化后行细胞计数，调整
细胞浓度分别为20×103，10×103，5×103 L-1，充分吹打均匀后接种于96孔板，每孔100 μL，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，24 h后观察并标记
只含有单个细胞的培养孔，补液至200 μL/孔，3 d换液，待标记孔细胞达95%汇合后胰蛋白酶+EDTA消化传代至48孔板中，标明1个细胞扩增的细胞群为一组，继续扩增培养至第3代，其中每组各取1孔细胞量接种于专一48孔板中，备免疫鉴定用。

PDLSC的鉴定：纯化后扩增培养第3代细胞，每组取1孔，吸去培养液，PBS洗涤3遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数0.2%Triton X-100处理后加体积分数3%H2O2，山羊血清工作液封闭30 min，滴加1∶100稀释的一抗，置湿盒内4 ℃过夜，次日复温后滴加1∶100稀释的FITC荧光二抗，37 ℃孵育1 h，hoechst工作液处理5 min，倒置荧光显微镜下观察，选取所有STRO-1阳性组
细胞扩增至第5代进行细胞增殖能力测定、PRP成骨诱导培养和AKP活性检测。

MTT法测定细胞增殖能力：取单克隆扩增培养阳性选择至5代细胞，胰蛋白酶
+EDTA消化，调整细胞浓度为2×106 L-1接种至96孔板，每孔200 μL，连续
培养12 d，每天设3个复孔行MTT法检测，酶标仪490 nm处读取吸光度值，
绘制细胞增殖曲线。

PRP诱导PDLSC成骨及鉴定：取第5代PDLSC按4×103/cm2接种于培养皿，
加入含体积分数10%胎牛血清，体积分数10%β-甘油磷酸钠的低糖DMEM培养基，按体积分数1%加入预先制备的好的PRP，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱
培养，3 d换液。

成骨诱导第21天的PDLSC细胞，吸弃上清，PBS洗涤3遍，40 g/L多聚甲醛固定，并行茜素红染色。

不同浓度PRP对AKP活性的影响：取第5代PDLSC按4×103/cm2接种于24
孔板，加入含体积分数10%胎牛血清，体积分数10%β-甘油磷酸钠的低糖DMEM培养基，分别加入体积分数0.8%，1.0%，1.2%PRP(实验组)，成骨诱导
细胞分别在第3，7，14，21天按AKP说明书测定各组AKP的活性，每组设6
个重复，对照组不加入PRP，其余培养基成分均与实验组相同。

主要观察指标：不同浓度PRP对PDLSC的成骨诱导作用。

统计学分析：数据以±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，多个样本间两两比较用SNK法，P ＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果
2.1 实验提取的PRP成分
瑞氏染色结果：镜下可见大量着色为紫色的散在和聚集成团状的血小板，见图1。

Figure 1 Reye staining results of platelets in extracted platelet-rich plasma. Yellow arrow points:aggregated platelets (×100)图1 提取的血小板血浆中的血小板瑞氏染色结果(×100)箭头所指为聚集的血小板
DGF-AB和TGF-β1含量测定结果：含体积分数10%PRP上清的DMEM中PDGF-AB含量为238 μg/L，TGF-β1含量为181 μg/L，说明制备并激活后的PRP中生长因子含量丰富。

2.2 分离培养的PDLSC形态及鉴定结果
PDLSC的形态：组织块培养三四天，在其边缘可见少量短梭形细胞贴壁生长，7～9 d细胞呈集落生长，13～16 d细胞集落扩大生长呈漩涡状，部分集落间开始汇合，见图2。

Figure 2 Morphology of tissue block cultured periodontal ligament stem cells (×100)图2 组织块分离培养的牙周膜干细胞形态(×100)
PDLSC纯化鉴定结果：采用STRO-1免疫荧光染色，倒置荧光显微镜下可见STRO-1特异性染色发绿色荧光，hoechst衬核为蓝色荧光，见图3。

Figure 3 Expression of periodontal ligament stem cells stromal cell antigen
1 (×50)图3 牙周膜干细胞基质细胞抗原1的表达(×50)
2.3 PDLSC的增殖能力测定结果 MTT结果显示，细胞接种后三四天进入对数生长期，八九天细胞达到平台期，见图4。

Figure 4 Proliferation curve of periodontal ligament stem cells图4 牙周膜干细胞的增殖曲线
2.4 PRP诱导PDLSC成骨情况见图5。

Figure 5 Osteogenic induction of periodontal ligament stem cells induced by platelet-rich plasma (×50)图5 富血小板血浆诱导的牙周膜干细胞的成骨情况(×50)
PRP诱导第14天，倒置显微镜下可见有散在的矿化结节，见图5a，21 d时肉眼可见培养皿中呈流沙样黑褐色小矿化结节，茜素红染色呈阳性，见图5b；5c为21 d空白对照组茜素红染色。

2.5 不同浓度PRP诱导PDLSC成骨的能力 AKP活性检测结果显示，成骨诱导第3，7天，各组间AKP活性差异无显著性意义(P ＞ 0.05)，第14天时，3个实验组AKP活性增高，其中体积分数1.0%PRP诱导的AKP活性最高(P ＜ 0.05)，体积分数1.2%的PRP次之，体积分数0.8%的PRP最低(P ＜ 0.05)；第21天，3个实验组的AKP活性降低，但体积分数1.0%PRP组仍高于另外2组(P ＜0.05)；而体积分数0.8%和1.2%PRP组间AKP活性差异无显著性意义(P ＞ 0.05)，见表1。

表1 不同培养时间各组小型猪牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性Table 1 Comparison of alkaline phosphatase activities in periodontal ligament stem cells in each group at different time points (±s, n= 6, A)aP ＜ 0.05, vs. control group; bP ＜ 0.05, vs. 1.0% platelet-rich plasma groupConcentration of platelet-rich plasma Time Control group 0.8% 1.0% 1.2%3 0.083±0.001 0.084±0.005 0.084±0.002 0.086±0.001 7 0.082±0.003 0.082±0.002
0.080±0.001 0.080±0.002 14 0.154±0.008 0.281±0.002ab 0.308±0.017a 0.297±0.010ab 21 0.194±0.013 0.218±0.001ab 0.227±0.000a
0.216±0.001ab(d)
3 讨论
牙周病是影响口腔健康的主要疾病之一，发病率高[3]，同时还可引发冠状动脉硬
化性心脏病[4-5]，与糖尿病等疾病的发生有密切的相关性[6-7]。

然而，临床的常规治疗只能恢复部分牙周组织，破坏吸收的骨组织难以自行修复[8]。

近年来，随
着组织工程理论和技术的成熟，利用组织工程对缺损的牙周组织进行修复成为研究的热点之一[9-10]。

已经有一些学者发现PRP有着明显的成骨作用，并且能够促
进软组织的再生和修复，加快组织愈合[11-12]。

PRP中含有多种生长因子[13]，
其中的PDGF-AB和TGF-β1在对硬组织如骨的缺损修复起着重要的作用[14-17]，其对骨组织缺损的修复有明显的促进作用[18]。

此外，PRP的制备来源于患者自体，且制备简单，在临床上有着良好的应用前景。

而由于小型猪的牙颌系统、牙体形态、牙齿生长发育特点，及具有乳牙和恒牙两副牙列等与人类极为相似，且易患人类某些口腔疾病，常被用作齿科疾病的模型动物[19]。

为此，实验观察了小型猪高纯度PDLSC成骨诱导中PRP的作用。

为了获取高浓度的PRP，Yuan等[20]和徐燕等[21]分别研究了2次和3次离心法制备PRP，经比较，3次离心法制备的PRP血小板计数是全血的8倍，优于2次
离心法。

实验采用3次离心法制备PRP，瑞氏染色观察到血小板的大量聚集。

PRP的激活是按常规的牛凝血酶联合CaCl2激活，诱导血小板脱颗粒释放介质和
细胞因子的方法。

实验通过有限稀释法克隆纯化了PDLSC，经早期间充质干细胞表面标记物STRO-
1鉴定为阳性[22-23]，证实为PDLSC后进行了扩大培养。

众所周知，β-甘油磷酸钠可以为细胞的矿化成骨提供磷酸盐，维生素C可以促进胶原的合成并且参与羟
基化反应即促进矿化。

为了验证PRP对STRO-1阳性细胞成骨作用的有效性，实
验设定对照组，发现在诱导约14 d，对照组镜下观察到细胞呈密集生长状态，未
见有细胞聚集和矿化结节，而添加PRP的细胞呈漩涡状聚集，漩涡中心可见有黑
褐色矿化结节，继续培养至第21天时，对照组细胞重叠生长，边缘卷起，茜素红染色阴性；PRP诱导的细胞肉眼可见培养皿内大量矿化结节沉积，以较大结节为
中心，四周散在有大量小块矿化结节，呈流沙状，茜素红染色呈阳性。

实验中诱导细胞出现大量的矿化结节，可以认为14～21 d细胞的矿化活动活跃。

由于AKP
水解磷酸盐形成羟基磷灰石晶体，并促进矿化物的形成[24]，AKP的活性与成骨
细胞的活性及成骨作用的变化密切相关，是成骨细胞分化成熟的标志之一[25]。

因此，实验通过AKP活性的检测进一步证实此阶段骨蛋白的合成增加，在成骨诱导
液中加入自体血分离制备的PRP进行诱导后，发现AKP活性在第14天达到峰值，而PRP终浓度在体积分数1.0%时诱导效果最佳。

与发现的PDGF-AB在10 μg/L 时是促进人PDLSC殖的最佳浓度的结果一致[26]，继续诱导至21 d，各实验组AKP活性均下降，这与AKP是成骨细胞早期表达物观点符合[27]，诱导第21天
可见有大量沉积的矿化结节，证明此期进入细胞矿化物形成的旺盛阶段。

同时对照组AKP活性在第14～21天持续升高，证实胎牛血清中含有激素和促生长因子，
在一定程度上也能够促进细胞的分化符合Herrera等[28]的研究。

与此同时，实验还对小型猪PDLSC扩增后的形态特征和增殖特性进行了检测，其形态与高秦等[29]研究的人PDLSC扩增后的成纤维样细胞一致，并且细胞的增殖
曲线与Lee等[30]研究的牙源性间充质细胞扩增后的增殖曲线相近。

进一步表明小型猪模型作为牙周病骨缺损修复的模型研究是可行的。

然而由于实验性小型猪相关生物学指标尚缺乏统一规范，PRP在成骨诱导中的作
用机制还有待于进一步深入探讨。

致谢：感谢新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞实验室马艳老师和毕晓娟老师对实验细胞研究过程中技术环节的指导，感谢新疆医科大学第一附属医院医学研究中心动物中心张春老师对动物手术操作实施的指导。

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