过表达foxc1对人非小细胞肺癌h1299细胞生物学行为的影响及其机制

FOXC1对人非小细胞肺癌H1299
细胞生物学行为的影响及其机制
韩乐，赵征，宋养荣，雷宝霞，陈文娟
（陕西省肿瘤医院，西安710061）
摘要：目的观察过表达叉头框转录因子Cl（FOXCl）对人非小细胞肺癌H1299细胞生物学行为及基质金属蛋白酶2（MMP-2）的影响。

方法将H1299细胞分为观察组与对照组，分别转染FOXC1目的基因质粒和空载体质粒。

转染48h后收集细胞，采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测细胞FOXC1mRNA和蛋白表达，MTT法检测培养1~8d的细胞增殖能力，平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,Transwell细胞侵袭实验检测穿过基底膜的细胞数,Western blotting法检测MMP-2蛋白相对表达量。

结果观察组细胞FOXC1mRNA及蛋白相对表达量均高于对照组（P均＜0.05）。

两组培养1~4d细胞增殖能力比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）,观察组培养5-8d细胞增殖能力均高于对照组（P均＜0.05）。

观察组细胞克隆形成率、穿过基底膜的细胞数、MMP-2蛋白相对表达量均高于对照组（P均＜0.05）。

结论过表达的FOXC1可能通过上调MMP-2表达而促进非小细胞肺
癌H1299细胞增殖及侵袭。

关键词：非小细胞肺癌;叉头框转录因子C1；基质金属蛋白酶2；细胞增殖;细胞侵袭
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2019.35.003
中图分类号:R734.2文献标志码:A文章编号：1002-266X（2019）35_0012-04
Effect of FOXC1over-expression on biological behavior of non-small-cell lung cancer
H1299cells and its mechanism
HAN Le,ZHAO Zheng,SONG Yangrong,LEI Baoxia,CHEN Wenjuan
(Shaanxi Provincial Cancer Hospital,Xi'an710061,China/
Abstract:Objective To observe the effect of FOXC1over-expression on the biological behavior and matrix metallo­proteinase2(MMP-2)of human non-small-cell lung cancer(NSCLC)cell line H1299.Methods H1299cells in the logarithmic growth phase were divided into the observation group and control group，which were transfected with FOXC1tar­get gene plasmid and empty vector plasmid，respectively.After48hours of transfection，FOXC1mRNA and protein expres­sion levels were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting,cell proliferation was detected by MTT，cell clone formation was detected by plate blotting，the number of cells passing through basement membrane was de­tected by Transwell cell invasion test，and MMP-2protein expression was detected by Western blotting.Results The rel­ative expression levels of FOXC1mRNA and protein in the observation group were higher than those in the control group (both P<0.05).There was no significant difference in the cell proliferation between the two groups at1-4days after cul­ture(P>0.05).The cell proliferation of the observation group was higher than that of the control group at5-8days after culture(P<0.05).The rate of cell clone formation，the number of cells passing through the basement membrane，and the relative expression of MMP-2protein in the observation group were all higher than those in the control group(all P<
0.05).Conclusion The over-expression of FOXC1can enhance the proliferation and invasion abilities of H1299cells
through up-regulating the expression of MMP-2.
Key words：non-small-cell lung caner;FOXC1;matrix metalloproteinase2;cell proliferation;cell invasion 肺癌是临床上发病率和病死率最高的恶性肿瘤⑴，非小细胞肺癌是其主要类型，约占85%[2]
基金项目:陕西省学基础（2019JM538/；陕西省卫健委卫生健康基金资助项目（2018D032/。

第一作者简介:韩乐（1984-），男，主,为肺癌发生及转移机制。

E-mail：56283859@
通信作者简介：陈文娟（1984-），女，主,为肺癌发生发展及转移机制。

E-mail：948551948@
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尽管随着放化疗和靶向治疗的不断完善以及免疫检测点抑制剂的应用，肺癌患者的预后得到很大改善,但原发耐药和继发耐药均严重影响患者预后，W期患者5年生存率仅为10%[3]o叉头框转
录因子C1（FOXC1）是FOX蛋白家族成员之一■，在多种肿瘤发生过程中发挥致癌基因作用⑷，并与肝癌、乳腺癌细胞的侵袭及转移密切相关[5,]。

2018年3~12月，本研究上调人非小细胞肺癌H1299细胞中FOXC1的表达，观察其对细胞生物学行为的影响，并对其机制进行初步探索。

现报告如下。

1材料与方法
1.1材料细胞:人肺腺癌H1299细胞取自株陕西省肿瘤医院实验室。

主要试剂：RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司;FOXC1抗体和基质金属蛋白酶2（MMP-2）试剂盒购自美国Abcam公司,鼠抗人0-actin抗体购自美国Sigma公司，二抗购自中杉金桥生物技术有限公司和美国GeneTex公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；FOXC1目的基因质粒、空载体质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。

1.2细胞分组处理将液氮中保存的H1299细胞进行常规复苏，加入含RPMI1640+10%胎牛血清的完全培养基进行常规培养。

取对数生长期的H1299细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为4 x105/mL,每孔2mL细胞悬液接种于6孔板，常规培养。

待细胞融合达40%~80%且细胞状态良好时,更换为无血清培养基，随机分为观察组和对照组。

观察组按照Attractene Transfection Reagent说明书在EP管中配置转染复合物，包含97.6咽TE buffer、.4p!FOXC1目的基因质粒、4.5p!At-tractene Reagent，后15min，6板中。

对照组采用同样的方法转染空载体质粒。

两组转染48h培养，行后实验。

1.3FOXC1表达检测①FOXC1mRNA表达:采用实荧光定PCR法。

两组转染48h的细胞，加入裂解液提取总RNA,测定浓度和纯度合格后，反转录合成cDNA,进行荧光定量PCR检测。

FOXC1上游引物5'-CGCCACAACCTCTCGCTCAAC-3',下游弓I物5'-TGTCCTTCTCCTTGTCCTTCA-3',弓|物长度21bp；内参0-actin上游引物5'-CTCCATC-CTGGCCTCGCTGT-3',下游引物5'-GCTGTCACCT-TCACCGTTCC-3',引物长度20bp；采用2-AA CT法计算FOXC1mRNA相对表达量。

②FOXC1蛋白表
：采用Western blotting法。

两组转染48h的细胞，加入蛋白裂解液，冰上充分裂解约30min,提
取总蛋白，进行蛋白定量并制备蛋白样品。

SDS-PAGE电泳，湿转法转膜,5%BSA摇床室温封闭1 h；1x TBST洗涤3次，每次15min。

加入DKK1（1：2000）和内参0-actin（1：8000）一抗,4°C孵育过夜，1xTBST洗涤3次，每次15min；加入二抗（1：2000）室温杂交1h,1xTBST洗涤3次，每次15 min;ECL显影、曝光。

采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值计算FOXC1蛋白对。

1.4细胞增殖能力观察采用MTT法。

收集两组转染48h的细胞,无培养基重,调整细胞度为1.5x104/mL，每孔200pL细胞悬液接种于96孔板，设置5个复孔，共8块孔板。

每天固定时间拿出1块孔板，加入20pL MTT试剂（5mg/mL）培养4h,弃掉孔中液体；加入DMSO150pL,酶标仪上测定492nm波长处的光密度（OD）值，连续检测8d0实验重3,均。

1.5细胞克隆形成能力观察采用平板克隆实验。

收集两组转染48h的细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为2x103/mL,每孔100pL细胞悬液接种于6孔板，补充细胞悬液至2mL o混匀后常规培养，当肉眼可见克隆形成时终止培养,PBS洗涤3次;甲醇固定15min,结晶紫染液染色20min,自来水冲洗，空气干燥。

计数可见克隆数，计算克隆形成率。

克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）x 100%。

实验重3,均。

1.6细胞侵袭能力观察采用Transwell细胞侵袭实验。

收集两组转染48h的细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为5x104/mL。

Matrigel基包Transwell基,干。

200 pL细胞液含8pm的Transwell上,500pL完全培养基,常规培养24 h o拿出小室,PBS冲洗，干净棉签擦去微孔膜内层细胞；甲醇固定15min，结晶紫染色20min,冲洗染液，室温风干。

随机选取10个视野，计数穿过基的细胞，均。

实验重3，均。

1.7细胞MMP-2蛋白表达检测收集两组转染48h的细胞，参照1.3采用Western blotting法检测MMP-2蛋白对。

1.8统计学方法采用SPSS24.0统计软件。

计量资料以x±S表示,组间比较采用t检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

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2结果
2.1两组细胞FOXC1mRNA及蛋白表达比较观察组细胞FOXC1mRNA及蛋白相对分别为0.950±0.020,1.540±0.020,对照组分别为0.010
±0.001,0.620±0.030，两组比较P均<0.05。

图1两组细胞FOXC1蛋白表达情况
(Western blotting法)
2.2两组细胞增殖能力比较两组培养1~4d细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P均> 0.05/，观察组培养5-8d细胞增殖能力均对
图2两组培养1~8d细胞增殖曲线(MTT法)
2.3两组细胞克隆形成能力比较观察组细胞克隆形成率为0.24%±0.01%,对照组为0.13%±0.01%，两组比较P<0.05。

见图3。

对照组
图3两组细胞克隆形成情况
2.4两组细胞侵袭能力比较观察组穿过基底膜的细胞数为(320.67±
3.06/个，对照组为(129.33±6.03)个,两组比较P<0.05。

2.5两组细胞MMP-2蛋白比较观察组细胞MMP-2蛋白相对为2.42±0.03，对照组为1.25±0.59，两组比较P<0.05。

见图4。

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图4两组细胞MMP-2蛋白表达情况
(Western blotting法)
3讨论
近年来，人来越重视转录因生、程中的作用，转录因子可以改变多种癌基因或抑癌基因，有望成为临床干的治疗靶［7］o FOX蛋白重要的转录因族,其主要特具状的DNA结合域,曹细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移等生物学过程均发挥重要作用2］。

FOXC1FOX成员，定人染色体6p25上，其编码的FOXC1蛋白由553个氨基酸构成［10］。

FOXC1最初被发现在统具作用,其基因已认为是Axenfeld-Rieger合的主要原因［11,12］。

FOXC1已被证实在肝癌、乳腺癌、白血病等多种恶性细胞中呈，并与细胞迁移及侵袭。

在乳腺癌细胞中，上调FOXC1表达可
乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而下调FOXC1表则产生相反作用，其机制可能与FOXC1导MMP-7表达有关山，4］。

在肝癌细胞中，过表达FOXC1可肝癌细胞发生上皮转化,导致肝癌细胞侵袭及转移能力增强，而下调FOXC1则可减弱上程，FOXC1可以上调锌指转录因子Snai1，但会下调钙黏附蛋白E "］。

研究表明，胃癌组织中FOXC1是
癌旁组织，且FOXC1与组织分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及浸润深度FOXC1高表达提示患者预后不良少］。

FOXC1可显著增加食癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力"］。

研究显示，FOXC1低表达的非小细胞肺癌患者生存时间长于FOXC1高表达者［18］。

本研究结，观察组细胞FOXC1mRNA及蛋白对均对照组，说明观察组成功转染FOXC1的基因质粒并FOXC1；本观察组培养5-8d细胞增殖能力、克隆形成率、穿过基的细胞均对照组，说
FOXC1可H1299细胞的增殖及侵袭能力。

MMP-2属于基质金属蛋白酶家族中成员中的明胶酶亚群，编码基因位于人染色体16q21。

MMP-2是一种明胶酶,可通过降解基底膜的重要组成成分W型胶原而促进肿瘤转移山]。

在肺癌组织中,MMP-2表达与肺癌转移倾向具有正相关性，下调MMP-2表达可以显著抑制肺癌转移[20]。

在肝细胞癌细胞中下调FOXC1表达,可以同时导致MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9表达下调，且会减弱肝细胞癌细胞的迁移及侵袭能力回]。

本研究结果显示，观察组MMP-2蛋白相对表达量明显高于对照组，提不过表达的FOXC1可能通过上调MMP-2表达而影响H1299细胞的生物学行为。

综上所述，过表达的FOXC1可能通过上调MMP-2表达而促进H1299细胞增殖及侵袭,为后续深入研究FOXC1在非小细胞肺癌中的作用机制奠定基础。

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(收稿日期：019-08-20)
15。