微生物及其用途[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710261585.6
(22)申请日 2017.04.20
(66)本国优先权数据
201610817947.0 2016.09.13 CN
(71)申请人 湖北广济药业股份有限公司
地址 435400 湖北省武穴市江堤路1号
(72)发明人 刘天罡　沈佳　石彬　叶紫玲　
马田　刘然　
(74)专利代理机构 北京清亦华知识产权代理事
务所(普通合伙) 11201
代理人 赵天月
(51)Int.Cl.
C12N 1/19(2006.01)
C12P 5/02(2006.01)
(54)发明名称
微生物及其用途
(57)摘要
本发明提出了一种微生物及其用途和获得
番茄红素的方法，该微生物过表达包括选自
tHMG1，BtCarG ，PaCrtB，McCrtI，INO2，yap1，
spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，
POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，
IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一；
以及沉默包括选自GAL1，GAL7，GAL10，GAL80，
ROX1，VBA5，DOS2，Ypl062W，Yjl064W，Yer130C，
Yer134C，Ynr063W，Exg1，Yor292C，Sfk1，Mef1基
因的至少之一。

利用根据本发明实施例的微生
物，生产番茄红素的产量高，生产周期短，生产效
率高。

权利要求书1页 说明书36页序列表45页 附图5页CN 107164254 A 2017.09.15
C N 107164254
A
1.一种微生物，其特征在于，
过表达包括选自tHMG1，BtCarG，PaCrtB，McCrtI，INO2，yap1，spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一；以及
沉默包括选自GAL1，GAL7，GAL10，GAL80，ROX1，VBA5，DOS2，Ypl062W ，Y jl064W ，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Exg1，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一。

2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物是酵母菌。

3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，进一步包括可操作调控ERG9基因。

4.一种获得番茄红素的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1～3任一项所述的微生物进行发酵处理；以及
将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述番茄红素。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵处理是通过如下方式实现的：将所述微生物进行基础发酵处理和两级分批补料发酵处理，所述基础发酵处理是在基本发酵培养基中进行的，所述两级分批补料发酵处理是通过在所述基本发酵培养基基础上依次补加第一补料培养基和第二补料培养基实现的，
其中，所述基本发酵培养基为含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.8％KH 2PO 4和2％葡萄糖的YPD含盐培养基；
所述第一补料培养基为含有500g/L葡萄糖，5g/L MgSO4，3.5g/L K 2SO 4，0.28g/L Na 2SO 4和10g/L酵母提取物的YPD含盐培养基；
所述第二补料培养基为乙醇或甘油。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述萃取处理包括：
将所述发酵处理产物进行匀浆破碎或酶解破碎处理以及有机萃取处理。

7.权利要求1～3任一项所述微生物在制备番茄红素中的用途。

权　利　要　求　书1/1页CN 107164254 A
微生物及其用途
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程领域，具体的，本发明涉及微生物及其用途，更具体的，本发明涉及微生物、获得番茄红素的方法和微生物在制备番茄红素中的用途。

背景技术
[0002]番茄红素的开发生产主要有天然产物提取、化学合成、微生物发酵等方法。

天然产物提取主要是通过成熟果实的萃取纯化获得番茄红素，然而这种生产方式受气候、品种、地理位置、成熟度等诸多不可控因素影响，具有明显的季节性，含量不稳定性，并且大面积种植、养殖的成本较高，含量通常也比较低。

另外，高纯度的番茄红素在萃取纯化技术上非常困难，这些共同造成了番茄红素的成品十分昂贵。

化学合成法具有原料易得价廉、反应条件温和、反应速率快、产物容易与反应体系分离的优点，但由于双键立体选择性难以控制及不同程度的化学试剂残留，其产品的质量、安全性及使用范围都受到了限制。

微生物发酵法主要是利用微生物的生物代谢，将葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉等廉价原料转化为番茄红素，这种方法不受季节、地域、气候等因素的影响，原料易获取、生产周期短、工艺操作简单、成本低廉、产物质量可控、产物易纯化、安全性高，并且环境污染较少，不仅解决了因种植植物等而占用大量耕地的问题，也解决了化学合成不环保的弊端。

最重要的是，发酵法生产的番茄红素属于天然型产品，其活性与天然植物提取的活性成分一致，被认为是番茄红素生产最有前景的方法。

发明内容
[0003]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

[0004]目前研究较多的番茄红素产生菌的主要是三孢布拉氏霉菌。

但是三孢布拉氏霉菌在传代过程中容易发生退化现象，使得番茄红素产量减少，另伴有黄曲霉毒素等有毒成分的合成，另一方面，这两种微生物的生长周期相较于酵母和大肠杆菌较长，大大降低了其生产效率，从而造成了生产番茄红素的难度加大。

[0005]为此，本发明的一个目的在于提出了一种微生物，该微生物生产番茄红素的产量高，生产周期短，生产效率高。

[0006]在本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。

根据本发明的实施例，所述微生物过表达包括选自tHMG1，BtCarG，PaCrtB，McCrtI，INO2，yap1，spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一；以及沉默包括选自GAL1，GAL7，GAL10，GAL80，ROX1，VBA5，DOS2，Ypl062W，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Exg1，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一。

利用根据本发明实施例的微生物，生产番茄红素的产量高，生产周期短，生产效率高。

[0007]根据本发明的实施例，上述微生物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0008]根据本发明的实施例，所述微生物是酵母菌。

酵母菌的生长周期短，利用本发明实
施例的微生物生产番茄红素的效率进一步提高。

[0009]根据本发明的实施例，所述微生物进一步包括可操作调控ERG9基因。

根据本发明的实施例，所述可操作调控ERG9基因包括但不限于替换ERG9基因的启动子，进而使得ERG9基因的表达可以根据需要进行调控，使微生物生产番茄红素的效率进一步提高。

[0010]在本发明的第二方面，本发明提出了一种获得番茄红素的方法。

根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的微生物进行发酵处理；以及将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述番茄红素。

利用根据本发明实施例的获得番茄红素的方法，能够高产量、高效率获得番茄红素，且番茄红素的纯度高。

[0011]根据本发明的实施例，上述获得番茄红素的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0012]根据本发明的实施例，利用根据本发明实施例的获得番茄红素的方法，获得的番茄红素产量更高、效率更高，纯度也更高。

[0013]根据本发明的实施例，所述发酵处理是通过如下方式实现的：将所述微生物进行基础发酵处理和两级分批补料发酵处理，所述基础发酵处理是在基本发酵培养基中进行的，所述两级分批补料发酵处理是通过在所述基本发酵培养基基础上依次补加第一补料培养基和第二补料培养基实现的，其中，所述基本发酵培养基为含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.8％KH2PO4和2％葡萄糖的YPD含盐培养基；所述第一补料培养基为含有500g/L葡萄糖，5g/L MgSO4，3.5g/L K2SO4，0.28g/L Na2SO4和10g/L酵母提取物的YPD含盐培养基；所述第二补料培养基为乙醇或甘油。

发明人通过实验发现，采用上述发酵处理方式，微生物的扩增速率高、番茄红素的产率也进一步提高。

[0014]根据本发明的实施例，所述萃取处理包括：将所述发酵处理产物进行超声破碎处理及有机萃取处理。

发明人对发酵产物进行萃取处理过程中发现，将发酵处理后产物进行超声破碎处理，相比于采用盐酸蒸煮的方法，番茄红素的降解大幅降低，萃取处理后获得的番茄红素的产量进一步提高。

[0015]在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述微生物在制备番茄红素中的用途。

如前所述，利用本发明实施例的微生物，生产番茄红素的产量高，生产周期短，生产效率高。

附图说明
[0016]图1是根据本发明实施例1的敲除盒片段1的结构示意图；
[0017]图2是根据本发明实施例1的敲除盒片段2的结构示意图；
[0018]图3是根据本发明实施例1的敲除盒片段3的结构示意图；
[0019]图4是在敲除GAL1/7/10和GAL1/7/10/80的菌株中的不同启动子的强度；[0020]图5是第二代工程菌株摇瓶发酵结果；
[0021]图6是根据本发明实施例4的敲除盒片段4的结构示意图；以及
[0022]图7是根据本发明实施例的发酵培养基的筛选结果图。

具体实施方式
[0023]下面详细描述本发明的实施例。

下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0024]微生物
[0025]在本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。

根据本发明的实施例，该微生物过表达包括选自tHMG1，BtCarG，PaCrtB，McCrtI，INO2，yap1，spt15-5，taf25-3，GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB，ADH2，ACS6，ALD6，EUTE，ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8基因的至少之一；以及沉默包括选自GAL1，GAL7，GAL10，GAL80，ROX1，VBA5，DOS2，Ypl062W，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Exg1，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一。

利用根据本发明实施例的微生物，生产番茄红素的产量高，生产周期短，生产效率高。

[0026]本申请所述的微生物用于生产番茄红素，相比于现有技术，其产量得到了显著提高，能够至少达到2g/L。

[0027]根据本发明的具体实施例，所述微生物还可以进一步包括可操作调控ERG9基因。

本申请所述的可操作调控ERG9基因是指替换ERG原始的启动子，从而实现通过葡萄糖调控ERG9的表达，从而增加番茄红素的产量。

[0028]需要说明的是，发明人通过实验，发现：表达BtCarG，PaCrtB，McCrtI基因能够达到在酵母体内高效合成番茄红素的目的；沉默GAL1，7，10或GAL1，7，10，80能够达到利用半乳糖诱导或利用葡萄糖浓度调节生产番茄红素的目的；表达INO2，yap1，spt15-5，taf25-3基因是抗逆基因，可以增加番茄红素的产量；表达GapN，PYC2，SMAE1，MDH2，POS5，pntAB中的一个或多个基因能够平衡酵母体内的还原力，可以增加番茄红素的产量；表达ADH2，ACS2，ALD6，EUTE中的一个或多个基因能够增加合成番茄红素的前体物质的供应，增加番茄红素的产量；表达ERG12，IDI1，ERG10，MVD1，ERG13，ERG8中的一个或多个基因，能够平衡有关番茄红素合成中的MVA途径，增加番茄红素的产量；沉默ROX1，VBA5，DOS2，Ypl062W，Yjl064W，Yer130C，Yer134C，Ynr063W，Exg1，Yor292C，Sfk1，Mef1基因的至少之一，能够从整体上调节酵母系统，从而增加番茄红素的产量。

利用根据本发明实施例的微生物，番茄红素的产量得到显著提高。

[0029]获得番茄红素的方法
[0030]在本发明的第二方面，本发明提出了一种获得番茄红素的方法。

根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的微生物进行发酵处理；以及将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述番茄红素。

利用根据本发明实施例的获得番茄红素的方法，能够高产量、高效率获得番茄红素，且番茄红素的纯度高。

[0031]根据本发明的具体实施例，所述发酵处理是通过基础发酵处理和两级分批补料发酵处理进行的，具体如下所述：
[0032]将保种管从-80度冰箱中取出放置冰上解冻，然后划YPD平板，于30度培养箱中培养，然后挑取单克隆至含5mL基本发酵培养基(为包含2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.8％KH2PO4和2％葡萄糖的YPD含盐培养基)(YPD是常用于培养酵母的一种培养基)的PA瓶中，30度摇床中培养，转速为220rmp。

待种子液变浑浊后(一般为指数期，OD＝5-8，14-18小时)转接至50mL新鲜的基本发酵培养基中(250mL三角瓶)，转接量为1％左右。

放于30度摇床中培养，转速为220rmp。

待种子液长至对数期时(一般14-18小时)转接至200mL新鲜的基本发酵培养基中(500mL三角瓶)，转接量为1％左右。

放于30度摇床中培养，转速为220rmp。

长至对数期的种子液作为上罐种子液。

初始接种OD调至0.5，所需种子液体积根据公式进行计算(如发酵液体积为2500mL，种子液OD值为n，则接种种子液体积为25000﹡0.5/n mL)。

开始发
酵后，控制pH值为5.5，通气量为1.5vvm，初始搅拌速率设置为300rpm，溶氧维持在30％以上(300-600rpm)。

[0033]当培养时葡萄糖浓度降至2g/L左右时开始补料葡萄糖(以补加第一补料培养基的形式提供，第一补料培养基为含有500g/L葡萄糖，5g/L MgSO4，3.5g/L K2SO4，0.28g/L Na2SO4和10g/L酵母提取物的YPD含盐培养基)，初始补料速率为10mL/L发酵液/h，以维持发酵液中葡萄糖的残留浓度在1g/L左右，每两个小时取样测量一次OD600值和检测一次葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于1g/L时增加补料速率。

当OD值增加缓慢时(开始进入稳定期)停止补料葡萄糖，此时开始监测乙醇残留量，当乙醇浓度降至5g/L时开始补料乙醇或者是甘油(第二补料培养基，包含乙醇或甘油)，初始补料速率为10mL/L发酵液/h。

随后每4h取样检测一次乙醇或甘油含量，当乙醇或甘油浓度低于5g/L时调整补料速率。

颜色有变化后开始提取产物检测产物变化，当番茄红素浓度不再增加时结束发酵。

[0034]其中，发明人发现，在基本发酵培养基中培养菌体，相比于现有技术的培养基，菌体的生长速度和生长状态均显著优于现有技术，补加的第一补料培养基，有效保证了菌体的快速和健康的生长，补加的第二补料培养基，有效提高了番茄红素的产量。

根据本发明的再一具体实施例，所述萃取处理包括：将所述发酵处理后产物进行超声破碎处理以及有机萃取处理。

发明人对发酵处理后的萃取过程进行了优化筛选，发明人发现，采用超声处理的方式相比于采用盐酸蒸煮的方式，番茄红素的降解速率大幅降低，番茄红素的产量稳定。

另外，需要说明的是，本申请所述的“有机萃取处理”是指采取有机溶剂对超声破碎处理产物进行萃取，有机萃取的方式不受特别限制，如根据本发明的具体实施例，可以采用丙酮溶剂从超声破碎处理产物中萃取番茄红素。

[0035]用途
[0036]在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的微生物在制备番茄红素中的用途。

发明人经过实验证实，本申请所述的微生物在生产番茄红素方面具有显著的优势，番茄红素的产量高、番茄红素的降解速率低，生产周期短。

[0037]下面详细描述本发明的实施例。

下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0038]实施例1 第一代工程菌株J1011-3的构建
[0039]在本实施例中，发明人详细介绍了J1011-3菌株的构建过程。

[0040]首先构建ΔLEU2：pGAL1-BtCarG(Blakeslea trispora)敲除盒，即敲除盒片段1，设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到ΔLEU2：：pGAL1-BtCarG(Blakeslea trispora)敲除盒，如敲除盒片段1如图1所示，敲除盒片段1具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母30000B基因组上，整合位点为LEU2，由于原酵母中的LEU2没有活性，而整合后的同源左臂含有LEU2完整基因，固转化后采用SD-Leu固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末1.3g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株命名为J1011-1。

[0041] ATAACGAGAACACACAGGGGCGCTATCGCACAGAATCAAATTCGATGACTGGAAATTTTTTGTTAATTTCAGAGGTC GCCTGACGCATATACCTTTTTCAACTGAAAAATTGGGAGAAAAAGGAAAGGTGAGAGCGCCGGAACCGGCTTTTCAT ATAGAATAGAGAAGCGTTCATGACTAAATGCTTGCATCACAATACTTGAAGTTGACAATATTATTTAAGGACCTATT GTTTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAATCGTCTTACTTTCTAACTTTTCTTACCTTTTACATTTCAGCAATATATATAT ATATATTTCAAGGATATACCATTCTAATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGTCGTTTTGCCAGGTGACCACGTTGGTCAA GAAATCACAGCCGAAGCCATTAAGGTTCTTAAAGCTATTTCTGATGTTCGTTCCAATGTCAAGTTCGATTTCGAAAA TCATTTAATTGGTGGTGCTGCTATCGATGCTACAGGTGTTCCACTTCCAGATGAGGCGCTGGAAGCCTCCAAGAAGG CTGATGCCGTTTTGTTAGGTGCTGTGGGTGGTCCTAAATGGGGTACCGGTAGTGTTAGACCTGAACAAGGTTTACTA AAAATCCGTAAAGAACTTCAATTGTACGCCAACTTAAGACCATGTAACTTTGCATCCGACTCTCTTTTAGACTTATC TCCAATCAAGCCACAATTTGCTAAAGGTACTGACTTCGTTGTTGTCAGAGAATTAGTGGGAGGTATTTACTTTGGTA AGAGAAAGGAAGACGATGGTGATGGTGTCGCTTGGGATAGTGAACAATACACCGTTCCAGAAGTGCAAAGAATCACA AGAATGGCCGCTTTCATGGCCCTACAACATGAGCCACCATTGCCTATTTGGTCCTTGGATAAAGCTAATGTTTTGGC CTCTTCAAGATTATGGAGAAAAACTGTGGAGGAAACCATCAAGAACGAATTCCCTACATTGAAGGTTCAACATCAAT TGATTGATTCTGCCGCCATGATCCTAGTTAAGAACCCAACCCACCTAAATGGTATTATAATCACCAGCAACATGTTT GGTGATATCATCTCCGATGAAGCCTCCGTTATCCCAGGTTCCTTGGGTTTGTTGCCATCTGCGTCCTTGGCCTCTTT GCCAGACAAGAACACCGCATTTGGTTTGTACGAACCATGCCACGGTTCTGCTCCAGATTTGCCAAAGAATAAGGTCA ACCCTATCGCCACTATCTTGTCTGCTGCAATGATGTTGAAATTGTCATTGAACTTGCCTGAAGAAGGTAAGGCCATT GAAGATGCAGTTAAAAAGGTTTTGGATGCAGGTATCAGAACTGGTGATTTAGGTGGTTCCAACAGTACCACCGAAGT CGGTGATGCTGTCGCCGAAGAAGTTAAGAAAATCCTTGCTTAAATTTAACTCCTTAAGTTACTTTAATGATTTAGTT TTTATTATTAATAATTCATGCTCATGACATCTCATATACACGTTTATAAAACTTAAATAGATTGAAAATGTATTAAA GATTCCTCAGGGATTCGATTTTTTTGGAAGTTTTTGTTTTTTTTTCCTTGAGATGCTGTAGTATTTGGGAACAATTA TACAATCGAAAGATATATGCTTACATTCGACCGTTTTAGCCGTGATCATTATCCTATAGTAACATAACCTGAAGCAT AACTGACACTACTATCATCAATACTTGTCACATGAGAACTCTGTGAATAATTAGGCCACTGAAATTTGATGCCTGAA GGACCGGCATCACGGATTTTCGATAAAGCACTTAGTATCACACTAATTGGCTTTTCGCGCAAATTAAAGCCTTCGAG CGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTTTGTACAGAAAAAAAAGAAA AATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTC TAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATA TCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTATATTGAATTTTCAAAAATTCTTACTTTTTTTTTGGATGGACGCAAAGAAGT TTAATAATCATATTACATGGCAATACCACCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAA AGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATAT TGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGCGACAGCCCTCCGACGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTGGTCTTCA CCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTT TATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATCAACGAATCAAATTAACAACCAT AGGATAATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTA ACAGATATATAAATGCAAAAGCTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTAT TCAAATGTCATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAAT GTTGACATCTTCAAAATCTATTGAGTCTTTTCCAAAAAATGTTCAACCATATGGTAAGCACTACCAGAATGGTTTGG AGCCAGTCGGTAAGTCTCAAGAAGACATTTTATTGGAACCATTCCATTACTTATGTTCAAACCCAGGTAAAGATGTC
AGAACTAAAATGATTGAAGCTTTCAACGCTTGGTTGAAGGTCCCTAAGGACGATTTAATTGTTATTACTAGAGTTAT TGAAATGTTACATTCTGCTTCTTTGTTAATTGACGATGTTGAAGATGATTCTGTTTTGAGAAGGGGTGTCCCAGCTG CACATCACATTTATGGTACACCACAAACTATTAATTGTGCAAACTACGTTTACTTTTTGGCTTTGAAAGAAATTGCT AAGTTAAATAAACCAAATATGATTACTATTTACACTGATGAATTGATAAATTTGCATAGAGGTCAAGGTATGGAATT GTTCTGGAGGGATACATTGACATGTCCAACAGAAAAAGAATTTTTGGATATGGTTAATGATAAGACTGGAGGTTTGT TGAGATTAGCTGTTAAATTAATGCAAGAAGCATCTCAATCAGGTACTGATTATACTGGTTTAGTTTCAAAAATTGGT ATACACTTTCAAGTTAGAGATGATTATATGAATTTGCAGTCTAAAAATTATGCTGATAATAAAGGTTTTTGTGAGGA TTTAACAGAAGGTAAATTCTCTTTCCCAATTATACATTCTATTAGATCTGATCCATCTAATAGACAATTGTTGAACA TTTTGAAACAAAGATCTTCTTCTATTGAATTGAAACAATTTGCTTTGCAATTATTGGAAAATACTAATACTTTCCAA TATTGTAGAGATTTTTTGAGAGTTTTGGAAAAAGAAGCTAGAGAAGAAATTAAATTGTTGGGTGGTAACATTATGTT GGAAAAGATTATGGATGTTTTGTCTGTTAATGAATAAGTCTGAAGAATGAATGATTTGATGATTTCTTTTTCCCTCC ATTTTTCTTACTGAATATATCAATGATATAGACTTGTATAGTTTATTATTTCAAATTAAGTAGCTATATATAGTCAA GATAACGTTTGTTTGACACGATTACATTATTCGTCGACATCTTTTTTCAGCCTGTCGTGGTAGCAATTTGAGGAGTA TTATTAATTGAATAGGTTCATTTTGCGCTCGCATAAACAGTTTTCGTCAGGGACAGTATGTTGGAATGAGTGGTAAT TAATGGTGACATGACATGTTATAGCAATAACCTTGATGTTTACATCGTAGTTTAATGTACACCCCGCGAATTCGTTC AAGTAGGAGTGCACCAATTGCAAAGGGAAAAGCTGAATGGGCAGTTCGAATAAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATT TGTACATAAACTTTATAAATGAAATTCATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATGGAATATGTTCATAGGGTAGA CGAAACTATATACGCAATCTACATACATTTATCAAGAAGGAGAAAAAGGAGGATGTAAAGGAATACAGGTAAGCAAA TTGATACTAATGGCTCAACGTGATAAGGAAAAAGAATTGCACTTTAACATTAATATTGACAAGGAGGAGGGCACCAC ACAAAAAGTTAGGTGTAACAGAAAATCATGAAACTATGATTCCTAATTTATATATTGGAGGATTTTCTCTAAAAAAA AAAAAATACAACAAATAAAAAACACTCAATGACCTGACCATTTGATGGAGTTTAAGTCAATACCTTCTTGAACCATT TCCCATAATGGTGAAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAAACGGCCTTAACGACGTAGTCGACCTCCTCTTC AGTACTAAATCTACCAATACCAAATCTGATGGAAGAATGGGCTAATGCATCATCCTTACCCAGCGCATGTAAAACAT AAGAAGGTTCTAGGGAAGCAGATGTACAGGCTGAACCCGAGGATAATGCGATATCCCTTAGTGCCATCAATAAAGAT TCTCCTTCCACGTAGGCGAAAGAAACGTTAACACACCCTGGATAACGATGATCTGGAGATCCGTTCAACGTGGTATG TTCAGCGGATAATAGACCTTTGACTAATTTATCGGATAGTCTTTTGATGTGAGCTTGGTCGTTGTC(SEQ ID NO：1)。

[0042]再构建ΔURA3：pGAL1-PaCrtB(Pantoea agglomerans)；pGAL10-McCrtI (Mucorcircinelloides)敲除盒，即敲除盒片段2，敲除盒片段2具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到ΔURA3：：pGAL1-PaCrtB (Pantoea agglomerans)；pGAL10-McCrtI(Mucorcircinelloides)敲除盒，敲除盒片段2如图2所示。

利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母J1011-2基因组上，整合位点为URA3，转化后采用SD-HIS固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺组氨酸的混合氨基酸粉末1.3g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株命名为J1011-2。

[0043] ACGCAGATAATTCCAGGTATTTTGAAGCAGAACTTTTATTTATCATCGAATTGACTATTGCATTATTTCTATTTTGC AAAGAGGAGAAAGAATTAGGAAAGTTCATACTTCAAAAAGTTTTCCAACTTTCTCACACGAAAGGCCTCACGAAAAG
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TCGTTTATCTTGCCTGCTCATTTTTTAGTATATTCTTCGAAGAAATCACATTACTTTATATAATGTATAATTCATTA TGTGATAATGCCAATCGCTAAGAAAAAAAAAGAGTCATCCGCTAGGGGAAAAAAAAAAATGAAAATCATTACCGAGG CATAAAAAAATATAGAGTGTACTAGAGGAGGCCAAGAGTAATAGAAAAAGAAAATTGCGGGAAAGGACTGTGTTATG ACTTCCCTGACTAATGCCGTGTTCAAACGATACCTGGCAGTGACTCCTAGCGCTCACCAAGCTCTTAAAACGGGAAT TTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACGCGCTGA CGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGAGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCC CAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTTTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTT GAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACT CCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCGAC AAAGGAAAAGGGGCCTGTTCAAATAACATTAGAATTATGAACTCTAAAAACTTCTGGCAACAAATTGTTAATAAAAG AAGCTGGAGTTTGACCGTTTGATTGTGGAAAGAAATAGAAAAACATGAACATAACCCAGAATGCAGCTCTTAACCAA AACCAAACTGGAAATGTTGATTCAGCATCTGGTTCTTCCAATGGTGCTTGAGTGTTTTCCATTTCGATCTTTCTTGG CTTTGGTGTTTTACCGAAAGACTTAACAACTTGATCAGAAGTCAACTTTGAACCTGCCAAAACAATTGGAACACCTG TACCTGGATGAGTTGAAGCACCAACGAAAAACAAATTATCGTATCTACCTGTAGAATCCTTAGTTGATGGTCTGAAC CACAAAACTTGCAAAACATCATGAGACAAACCCAAGATTGAACCTCTCCACAAATTAAACTTAGATTGCCAAACTGC TGGATCGTTAACTTGTTCATGTTCGATCAAATCAGCGAAGTTTGACATGCCCAATCTTCTTTCAATAACTGCCAAAA CCATCTTTCTTGCCTTATCAACCATAGCTGGATAATTTTCTGTAGATGCGTCACCAGTTTTTGACTTCATATGACCG ATTGGAACCAAAACAATAACAGAATCTTTACCATCTGGTGCAGCAGATGGATCGATTCTTGATGGAACGTTAACGTA GAAAGAAGCTTCTGATGGCAAACCGAAATCCTTAAAAATTTCATCGAATGATTCTTGGTATGCTTCAGCCAAGAAAA TGTTATGAACATCCAATTGTGGAACCTTAGTAGACATTGACCAGTAGAAAGAGATAGATGAAGATGTCAATTTCTTA GAAGCCAATGTGTTTTGAGTCCATCTACATGGTGGTAACAAATTATGGTATGCGTAAACCAAATCAGCATTACAAAC AACTGCATCAGCATCGATGATATGACCGTTTTCCAATGTAACACCAGTAACTTGCTTTGTTGCATCATCAGTATTAA TCTTTGCAACTGGAGCGTTATATATGAATTCAGCATCGTACTTTTGCTTTGCGATAGCTTCCAACTTTTGAACAACC ATATTAAAACCACCTCTTGGATACCAAATACCTTCAGCAAATTCAGTGTATTGCAACAAAGAGTAAACTGCTGGAGC ATCGTATGGTGACATGCCCATGTACATTGTTTGGAAAGTAAAAGCCATTCTCATTTTCTTAGTCTTGAAGTACTTAG ATGCTCTATCATAGATTTTACCGAACAAATGCAATCTAAAAATTTCTGGTGCGTATTTAATTCTGATCAAATCCCAG ATAGATTCGAAATTTTTCTTCAAAGCGATCAATGTACCTGATTCGTAATGGATATGAGTTTCCTTCATGAAATCTAA AAATCTACCGAAACCCAATGGACCTTCAACTCTATCCAATTCAGCTTTCATTCTAGTCAAATCTGAAGACAATTGGA TAGATTCACCATCATCGAAATGAACCTTGTAGTTGTTATCACATCTCAACAATTCCAAATGATCTTGGATTCTTTCA TCCAAATCTGCGAAAGCATCTTCGAAGTACTTTGGCATCAAATACAAAGATGGACCTTGATCGAATCTATGACCTTG ATGATGGATCAATGAACATCTACCACCACCAAAATCATTCTTTTCAACAACTGTAACTTTAAAACCTTCTCTAGCCA ATCTTGCAGCTGTTGCAGTACCACCAACACCAGCACCGATGATAACGATATGTTTCTTAGACATTTATATTGAATTT TCAAAAATTCTTACTTTTTTTTTGGATGGACGCAAAGAAGTTTAATAATCATATTACATGGCAATACCACCATATAC ATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCT TTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGCGACAG CCCTCCGACGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTGGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGC CGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGG CCCCACAAACCTTCAAATCAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATAATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTC TGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAGCTGCATAACCACTTT
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[0044]再构建Δgal1，Δgal7，Δgal10:pGAL10-tHMG1敲除盒，即敲除盒片段3，敲除盒片
段3具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

设计上、下游引物PCR扩增各片段，使其相互之间有60-80bp的重叠片段，再通过同源重组的方式将所有片段重组在一起，通过酶切线性化得到Δgal1，Δgal7，Δgal10::pGAL10-tHMG1敲除片段，敲除盒片段3的结构如图3所示。

利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化分别整合到酵母J1011-2基因组上，整合位点为GAL1，GAL7和GAL10，转化后采用SD-Trp固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/ L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸的混合氨基酸粉末1.3g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，成功验证的菌株命名为J1011-3.
[0045] TTCACCGATTCTGAGCGAATCACAGGTGAGAAATTTGGATTCGAAATAAACCTAAAAAAACTATCCAATAAGGCTTC CATAGGCTTCGTATTTCCCGACCATTCCAATTGGAAAAATTGAGCGCTGTCTTCCATGATCTTAGATAAAGCCTTAA TACTTGGCTCATTTCCATTTGAGGTTAGCTCTAGCAACTGGTAAAGCATTTGAAGACCAGTTGGATCATCTCTATGC TGCCTATAGTAAGTGGAAAATAAAGTAGTAATAACGATACCTGTCACGTTCGAAACGAGATTATTGTTCGAATTATA AAGGCCATGTATAATGTTTGATTTGACGTATCCTAAGTCGTGGCTATTGCTCTTAATTAAATTGTTTCCCCCTAGCA TTGAATTTTTCAACAGCATACCGGCGGTAGCTCTATTGTTCTGAAGATCCTGTAGGGAGTAGTGTTGCTTCAATACA TCATCAGATTCGCCTTCAATTAAAATATAACACAAATAATTGAGAAATTCAGGTTGCAGCTGGAAGTTCTCCATAGC TTCCATTGCGTTATTACGAATCTCTGGATTTGGTGACATACAGTTCTGTAAAAGAGTTGCTAGTTGCAACACATAGT CTTCGGCGGGCTTCCATGTCGATGCCATCTTTATTCACTTAACTACTGCTAACAATTCTGGAAACCAAAGACTGCGG AATATTCTGATATGTATTACTACTATTCGCTGCTCTTCTGCATAATTAATACTGAAAAGTTTTTCATACTTTTAAAC ATAACCTTTTTTTAAGCAAAACTCTATGACCCGGATTAGAAAACTACGAAAAGAGGGTAATAACATAGGTGCAGGAT TTCCATCGATAACGACGCCGACAATGAGCCTTGCTGCAACATCCAATTAGGACTAATAACTATCGTAGGAATTTCTA CGTAATAAACTTCAACAGAGCCTAAAATTTGAAAATAAATAATCTAGAGGGGAAACTTAAAGAAATTCTATTCTTGT CAATAAAGTGGAAATCTGTCAGATGTCACAGTTTCTTTATTTGTGACACATATTTTCAACATAAATTCAGGCATTAG TGCTGTAAGCACAAAAAGTTGTGGCGATATGAATATTCCAGATTTTACTTACAAGCTGCATTGTAGTCTTACAATTC TTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTATGGAAAGGACCACTCTTACATAACTAGAATAGCATTAAGAATCAGATTTACAGAT AAAGATGACATTATTTTATATATATATTGTCACTCCGTTCAAGTCGACAACCAATAAAAAATTTAAAAAAAGCCAGG CAGTTAATAGAAAAAATATGATATGAATGAATATTCCACTTTCTTTTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAG CAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGA TTGTACTGAGAGTGCACCATAAACGACATTACTATATATATAATATAGGAAGCATTTAATAGACAGCATCGTAATAT ATGTGTACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAAAAATAGCTTGTCACCTTAC GTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCCGATTAAGAATTAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCC AAGAGGGAGGGCATTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGTCT GTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGC TCTAGATTCCGATGCTGACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGGTTATTGCAA GGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGGCACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAAT CAACCTAAGGAGGATGTTTTGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAGTCGTG GCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGTATTTCCAAAAGACTGCAACATACTACTCA GTGCAGCTTCACAGAAACCTCATTCGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGAT TGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAGCCCCGAAAGCTTACATTTTATGTTAGCTGGTGGACTGAC GCCAGAAAATGTTGGTGATGCGCTTAGATTAAATGGCGTTATTGGTGTTGATGTAAGCGGAGGTGTGGAGACAAATG
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CCCCACAAACCTTCAAATCAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATAATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTC TGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAGCTGCATAACCACTTT AACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTCATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAA TATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAGCGCAATGATTGAATAGTCAAAGATTTTTTTTTTTTAA TTTTTTTTTTTTCATAGAACTTTTTATTTAAATAAATCACGTCTATATATGTATCAGTATAACGTAAAAAAAAAAAC ACCGTCAGTTAAACAAAACATAAATAAAAAAAAAAAGAAGTGTCAAATCAAGTGTCAAATGTATACTTCTTTTTTTT ACTTTGTTCAGAACAACTTCTCATTTTTTTCTACTCATAACTTTAGCATCACAAAGTACACAATAATAACGAGTAGT AACACTTTTATAGTTCATACATGCTTCAACTACTTAATAAATGATTGTATGATAATGTTTTCAATGTAAGAGATTTC GATTATCCACAAACTTTGAAACACAGGGACACAATTCTTGATATGCTTTCAACCGCTGCGTTTTGGATACCTATTCT TGACATAATATGACTACCATTTTGTTATTGTACGTGGGGCAGTTGACGTCTTATCATATGTCAAAGTCATTTGCGAA GTTCTTGGCAAGTTGCCAACTGACGAGATGCAGTAAAAAGAGATTGCCGTCTTGAAACTTTTTGTCCTTTTTTTTTT CCGGGGACTCTACGAGAACCCTTTGTCCTACTGATTAATTTTGTACTGAATTTGGACAATTCAGATTTTAGTAGACA AGCGCGAGGAGGAAAAGAAATGACAGAAAAATTCCGATGGACAAGAAGATAGGAAAAAAAAAAAGCTTTCACCGATT TCCTAGACCGGAAAAAAGTCGTATGACATCAGAATGAAAAATTTTCAAGTTAGACAAGGACAAAATCAGGACAAATT GTAAAGATATGATAAATCATTTGATTCAGCGCCAATTTGCCCTTTTCCATTTTCCATTAAATCTCTGTTCTCTCTTA CTTATATGATGATTAGGTATCATCTGTATAAAACTCCTTTCTTAATTTCACTCTAAAGCATACCCCATAGAGAAGAT CTTTCGGTTCGAAGACATTCCTACGCATAATAAGAATAGGAGGGAATAATGCCAGACAATCTATCATTACATTTAAG CGGCTCTTCAAAAAGATTGAACTCTCGCCAACTTATGGAATCTTCCAATGAGACCTTTGCGCCAAATAATGTGGATT TGGAAAAAGAGTATAAGTCATCTCAGAGTAATATAACTACCGAAGTTTATGAGGCATCGAGCTTTGAAGAAAAAGTA AGCTCAGAAAAACCTCAATACAGCTCATTCTGGAAGAAAATCTATTATGAATATGTGGTCGTTGACAAATCAATCTT GGGTGTTTCTATTCTGGATTCATTTATGTACAACCAGGACTTGAAGCCCGTCGAAAAAGAAAGGCGGGTTTGGTCCT GGTACAATTATTGTTACTTCTGGCTTGCTGAATGTTTCAATATCAACACTTGGCAAATTGCAGCTACAGGTCTACAA CTGGGTCTAAATTGGTGGCAGTGTTGGATAACAATTTGGATTGGGTACGGTTTCGTTGGTGCTTTTGTTGTTTTGGC CTCTAGAGTTGGATCTGCTTATCATTTGTCATTCCCTATATCATCTAGAGCATCATTCGGTATTTTCTTCTCTTTAT GGCCTGTTATTAATAGAGTCGTCATGGCCATCGTTTGGTATAGTGTCCAAGCTTATATTGCGGCAACTCCCGTATCA TTAA(SEQ ID NO：3)。

[0046]更进一步，发明人通过实验验证，J1011-3具有高产番茄红素的性能，同时过表达BtCarG，PaCrtB，McCrtI基因所获得的酵母菌株，其番茄红素的产量优于其它基因组合。

[0047]在以下实验中，发明人进一步对J1011-3菌株进行改造，具体如下所述：[0048]实施例2 启动子和终止子的选择
[0049]为了能用半乳糖进行诱导，需要敲除代谢半乳糖的基因GAL1,GAL7,GAL10。

因此特征启动子的背景菌株为敲除基因GAL1,7,10。

半乳糖价格较高，并不适用于工业化生产，因此在敲除基因GAL1,7,10的基础上敲除GAL80，以期通过对葡萄糖量的控制达到对基因表达的调控。

所得到的启动子信息用于构建控制类胡萝卜素合成相关基因的表达。

[0050]如图4所示，在ΔGAL1/7/10/80菌株和ΔGAL1/7/10菌株中不论是诱导型启动子或是组成型启动子在稳定期强度基本一致。

可见，敲除GAL80可以起到不加半乳糖即可诱导基因表达，诱导强度跟与半乳糖诱导强度相当。

[0051]酵母属于真核生物，在其体内过表达基因需要选择合适的启动子和终止子，经过反复多次实验，发明人选择了P GAL1，P GAL7，P GAL10，P GAL1-10，P GAL10-1和P HXT1作为表达基因的启动。