法夫酵母 JMU-MVP14菌体中类胡萝卜素成分分析

法夫酵母 JMU-MVP14菌体中类胡萝卜素成分分析
李慧翔;伍菱;黄高凌;杨远帆;肖安风;杜希萍
【摘要】结合薄层色谱、柱色谱、以及高效液相色谱对虾青素高产菌株-法夫酵母JMU-MVP14中的类胡萝卜素成分进行初步研究。

研究结果表明，硅胶柱层析和氧化镁柱层析相结合的方法对法夫酵母JMU-MVP14菌体中的类胡萝卜素成分有很好的分离效果。

经过柱层析分离纯化后，各组分中类胡萝卜素的种类单一，有利于进一步通过各种波谱技术对其进行定性。

此方法弥补了单纯依靠高效液相色谱（ODS 柱）对法夫酵母 JMU-MVP14菌体中类胡萝卜素分离效果不佳，可供选择的商业化类胡萝卜素标准品少，液相保留时间漂移等因素给法夫酵母JMU-MVP14菌体中类胡萝卜素定性带来的不足。

%Carotenoids in Phaffia rhodozyma JMU-MVP14 were analyzed by combining the methods of TLC, CLC (column liquid chromatography)and HPLC.With the combining of MgO-CLC and silica gel-CLC,carotenoids in Phaffia rhodozyma JMU-
MVP14 were separated well into several fractions,each fraction with an individual carotenoid. Unsatisfactory separation and drifting of Rt (retention time)in HPLC method in which ODS column was employed,and shortage of available commercial carotenoid standards made it difficult to identify the carotenoids in Phaffia rhodozyma JMU-MVP14.The method mentioned in this paper overcame the above defects.
【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2014(000)003
【总页数】6页(P234-238,263)
【关键词】法夫酵母;类胡萝卜素;柱层析;HPLC
【作者】李慧翔;伍菱;黄高凌;杨远帆;肖安风;杜希萍
【作者单位】集美大学生物工程学院，福建厦门361021;集美大学生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021;
福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建厦门361021; 厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建厦门361021; 厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建厦门361021; 厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建厦门361021; 厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程
重点实验室，福建厦门361021; 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建厦门361021; 厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门361021
【正文语种】中文
【中图分类】Q932
虾青素(3，3'-二羟基-β，β'-胡萝卜素-4，4'-二酮)是一种极具开发潜力的功能色素，属于类胡萝卜素中的一种。

大量的体外实验、动物实验、以及临床实验证明虾
青素具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗癌、提高机体免疫等功效［1-6］。

在食品、医药、化妆品、水产养殖、畜禽养殖等行业有广泛的应用前景。

法夫酵母最早由Herman Phaff于1972年从日本和阿拉斯加阔叶树流出物中分离得到［7］，因其显著的虾青素合成能力而受到广泛的关注。

自法夫酵母发现至今，为了使法夫酵母生产虾青素变为可能，国内外的学者做了大量的研究，包括虾青素高产菌株的选育［8］，发酵条件的优化［9，10］，提取条件的优化［11-13］。

其中虾青素高产菌株的选育多采用突变育种［14，15］，改变法夫酵母的代谢途径，以期望获得虾青素的高产菌株。

在已获得的虾青素高产菌株中，由于代谢途径的改变，必然引起菌株中类胡萝卜素种类与含量的改变。

比较突变前后菌株中的类胡萝卜素种类，可能会有一些新的类胡萝卜素在突变后的菌株中被检测到，也有一些类胡萝卜素从突变后的菌株中消失［16，17］。

法夫酵母 JMU-MVP14 菌株为本实验室由出发菌株法夫酵母 Pst-1通过一系列突变选育得到的一株虾青素高产
菌株。

前期研究表明，法夫酵母 JMU-MVP14菌体中总类胡萝卜素体积产率、虾青素体积产率、总类胡萝卜素细胞产率、虾青素细胞产率分别是 28.45 mg/L、16.53 mg/L、10.38 mg/g及6.01 mg/g，其中虾青素只占到总类胡萝卜素含量
的57%，多达43%的其他类胡萝卜素成分是不明确的［18］。

本文结合薄层色谱、柱色谱、以及高效液相色谱对法夫酵母JMU-MVP14菌体中类胡萝卜素成分进行
研究，以期获得单一的类胡萝卜素成分，以便此后进一步通过波谱技术对其进行定性;同时进一步了解法夫酵母JMU-MVP14菌株的代谢途径，为后续对该菌株进行基因改造提高虾青素产量提供理论依据。

1 材料和方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 实验材料
法夫酵母菌体，由集美大学生物工程学院发酵研究室选育菌种法夫酵母JMU-
MVP14发酵得到;甲醇、丙酮，乙酸乙酯，氢氧化钠、浓盐酸均为国产分析纯试剂;色谱纯甲醇，购自美国Tedia公司;石油醚为国产工业纯试剂重蒸馏得到;石英砂、氧化镁、硅藻土均为国药集团化学试剂有限公司分析纯试剂;200-300目硅胶、薄
层层析硅胶板GF254(青岛谱科分离材料有限公司);各种规格玻璃色谱柱(定制)。

1.1.2 实验仪器
安捷伦1200高效液相色谱仪，CARY50型紫外-可见全波长扫描仪，METTLER TOLEDO pH计，LXJIIB离心机，BS233S电子天平，BC/BD-318A型海尔冰柜，RE-52AA型旋转蒸发仪，SHZ-Ⅲ D型循环水真空泵。

1.2 方法
1.2.1 总类胡萝卜素的提取
称量一定量的法夫酵母菌体，按以下流程进行提取。

具体操作如下:将市售浓盐酸(12 mol/L)用蒸馏水稀释四倍配成3 mol/L的盐酸，按料液比1∶5(w/v)于室温、避光条件下对法夫酵母菌体进行破壁30 min。

4500 r/min离心5 min，弃去上
层酸液，下层菌体用蒸馏水制成菌悬液。

用氢氧化钠将菌悬液中和到pH 7.0，离
心弃去上清液，菌体用蒸馏水洗涤三次以脱除中和产生的盐。

先用丙酮对水洗后的菌体提取2次，料液比为1∶15(w/v)，4500 r/min离心5 min，取上清液。

菌体残渣依次用乙酸乙酯、石油醚分别提取两次，取上清液。

合并丙酮、乙酸乙酯、石油醚三部分的上清液，减压蒸发浓缩除去有机溶剂，得到法夫酵母JMU-MVP14
菌体总类胡萝卜素提取物浸膏，－20℃低温保存，以备后续研究。

1.2.2 总提取物全波长扫描
取少量总类胡萝卜素提取物浸膏用适量的氯仿完全溶解，用等量的甲醇稀释。

以氯仿/甲醇(1∶1)混合溶剂做空白，置于1 cm的玻璃池中，用紫外-可见分光光度计
在190-800 nm范围进行全波长扫描，样品的浓度调节到最大吸收波长下的吸光
值在0.1-1.5范围内为宜。

1.2.3 类胡萝卜素的柱层析分离
由于法夫酵母JMU-MVP14菌体中的类胡萝卜素成分比较多，且同种类胡萝卜素
还有多种顺反异构体，加大了分离的难度，在分离纯化的过程中要选择多种固定相相结合的办法才能达到有效的分离，因此先用硅胶柱对法夫酵母JMU-MVP14菌
体中总类胡萝卜素提取物进行硅胶柱粗分段，再用氧化镁柱对各组分细分。

1.2.3.1 硅胶柱粗分段称量100 g 200-300目的硅胶，110℃烘箱活化2 h，冷却后用石油醚湿法装填一根规格为40×200 mm的玻璃柱，硅胶自然沉降后用石油
醚平衡至柱床体积不再变化为止。

总类胡萝卜素提取物浸膏以尽可能少的石油醚溶解，湿法上样，待样品都吸附到色谱柱上端的固定相中，以石油醚/丙酮梯度洗脱，按色带收集洗脱组分。

洗脱组分真空浓缩至干，－20℃低温保存备用。

1.2.3.2 氧化镁柱层析硅胶分段得到的各组分再经氧化镁柱进一步分离，柱子规格视样品质量而定。

装柱操作如下［19］:氧化镁与硅藻土按质量比1∶1混合，110℃烘箱活化2 h。

冷却后将填料均匀地装入空柱管，待装填到所需要的高度后，用真空泵从柱子底端抽真空，将填料压实，并确保柱上表面填料平整。

以石油醚在一定压力下平衡柱子，直至柱子下端流出液连续，没有气泡为止。

样品溶解后湿法上样，以石油醚/丙酮梯度洗脱。

洗脱组分真空浓缩至干，－20℃低温保存备用。

1.2.4 硅胶薄层色谱分析各组分中的类胡萝卜素成分
以氯仿溶解样品，用硅胶G薄层层析板对分离得到的各组分进行薄层色谱分析。

展开剂为石油醚/丙酮、石油醚/乙酸乙酯和氯仿/甲醇三个体系。

1.2.5 总类胡萝卜素提取物浸膏以及柱层析组分的HPLC分析
总类胡萝卜素提取物浸膏以及柱层析所得到的各组分用氯仿溶解后以等体积的甲醇稀释，0.22 μm的有机膜过滤，用HPLC分析。

色谱条件如下:色谱柱为 Nova-Pak 3.9×150 mm C18柱，4 μm 粒径;35℃柱温;475 nm检测波长(检测波长选
择为1.2.2中紫外分光光度计全波长扫描得到的最大吸收波长);流动相为甲醇-水体
系，0-40 min甲醇 85%-100%，41-58 min甲醇100%，59-66 min甲醇100%-85%;流速 1 mL/min。

2 结果与分析
2.1 总类胡萝卜素提取物的紫外-可见吸收光谱
法夫酵母JMU-MVP14菌体中总类胡萝卜素提取物的紫外-可见吸收光谱如图1
所示。

总提取物在475 nm处有最大吸收，与文献报道的虾青素的吸收波长相符。

虽然法夫酵母JMU-MVP14菌体中总类胡萝卜素提取物中还包含其他类胡萝卜素，但是虾青素是其中的主要色素，所以总提取物的紫外-可见光谱表现为虾青素的特
征吸收。

图1 总类胡萝卜素提取物的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-VIS spectrum of total carotenoids
2.2 总提取物中类胡萝卜素成分的高效液相分析
利用高效液相色谱法对总提取物中的类胡萝卜素做初步分析，结果如图2所示。

在475 nm检测波长下，总提取物中总共检测到7个主要的峰。

通过在线DAD检测器获取这7个峰的紫外-可见光谱图，他们都在400-500 nm显示最大吸收，根据文献报道［20］，可以初步断定这7个峰都是类胡萝卜素成分。

由于高效液相色谱进样量少，样品浓度低，在总提取物中部分类胡萝卜素会因为含量低于检测限而不能被检测到。

此外，没有一种液相方法可以做到将所有的类胡萝卜素完全分离，极性相近的两种类胡萝卜素会因为不能被完全分离，其中含量较少的类胡萝卜素会被与之极性相近且含量较高的类胡萝卜素峰掩盖。

以上两个因素都使得高效液相色谱检测到的类胡萝卜素种类少于菌体中实际所含有的种类数。

2.3 法夫酵母JMU-MVP14菌体中类胡萝卜素成分的分析
2.3.1 硅胶柱层析组分的分析
经过硅胶柱层析，总提取物被分成四个组分，分别命名为A、B、C、D。

组分A、
B分别为黄色和红色油状物，在石油醚里溶解性好，－20℃低温过夜底部有白色
沉淀，可能为脂质。

组分C为红色粘稠浸膏，在石油醚里溶解性差，易溶于二氯
甲烷。

组分D为红色固体，易溶于二氯甲烷。

图3(a)、3(b)分别为组分C、D的
硅胶薄层色谱，展开剂为石油醚/丙酮(5∶1)。

(组分A、B薄层不形成清晰的类胡
萝卜素斑点，薄层色谱图未在文中给出)。

图2 总提取物中类胡萝卜素成分的高效液相色谱图Fig.2 HPLC of total carotenoids
图3 组分C、D的薄层色谱图Fig.3 TLC of fractions C and D
2.3.2 氧化镁柱纯化组分的色谱及光谱分析
组分A、B、C、D经过氧化镁柱多次纯化总共得到9种类胡萝卜素，其中组分A
中3种，组分B中1种，组分C中1种，组分D中4种，分别命名为A-1、A-2、A-3、B-1、C-1、D-1、D-2、D-3、D-4。

9 种类胡萝卜素的薄层色谱如图4所示，除C-1外，其余组分在薄层色谱上都显示单一的类胡萝卜素斑点。

对这9种
类胡萝卜素进行高效液相色谱分析，C-1显示两个相连的色谱峰(肩峰)，其余都显示单一色谱峰，利用在线DAD检测器获取各个色谱峰的紫外-可见吸收光谱。

9种类胡萝卜素的色谱以及光谱数据如表1所示，除A-1、A-2、A-3的光谱显示为典型的三指吸收峰外，其余组分的光谱都显示为单一的圆峰。

据相关文献报道，法夫酵母的类胡萝卜素合成途径中包含有虾青素、海胆酮、羟基海胆酮、DCD、HDCD等羰基类胡萝卜素［21，22］。

当羰基与骨架多烯链共轭，使这些类胡萝卜素在有机溶剂中的光谱精细结构损失，光谱显示为一个单独、较宽的圆峰［23］，因此可以推断组分 B-1、C-1、D-1、D-2、D-3、D-4 为含羰基的类胡
萝卜素，可能为虾青素、海胆酮、羟基海胆酮、DCD、HDCD中的一种或几种。

这给依靠光谱对类胡萝卜素进行定性带来了困难，可以通过进一步对分离得到的单一类胡萝卜素组分进行质谱、核磁共振分析辅助定性。

图4 氧化镁柱层析所得9种类胡萝卜素的薄层色谱Fig.4 TLC of the nine carotenoids separated by MgO column chromatography
表1 法夫酵母JMU-MVP14菌体中分离得到的9种类胡萝卜素的色谱及光谱特征Tab.1 Chromatography and spectrum characteristics ofthe nine carotenoids separated from Phaffia rhodozyma JMU-MVP14注:a、b所代表的展开剂分别为石油醚、石油醚/丙酮(5∶1)Note:a and b represent for developing solvents of petroleum ether and petroleum ether/acetone样品编号 TLC上Rf值/nm A-1 0.98a 46.12 (426)，450，高效液相保留时间/min最
大吸收波长475 A-2 0.97a 47.53 430，461，(493)A-3 0.96a 48.71 (417)，444，468 B-1 1.00b 37.07 462 C-1 0.64/0.69b 32.78/33.29 466/452 D-1 0.50b 38.80 465 D-2 0.35b 33.17 465 D-3 0.31b 20.73 477 D-4 0.21b 14.64 475
3 讨论
法夫酵母JMU-MVP14菌体中的类胡萝卜素成分众多，其中有些类胡萝卜素之间
由于结构非常相近，单纯依靠高效液相色谱(ODS柱)很难将其分离开来，在高效
液相上表现为保留时间一致。

此外，可供选择的商业化类胡萝卜素标准品少，价格昂贵;不同批次进样，同一类胡萝卜素的高效液相色谱保留时间在一定范围内波动。

以上这些因素都给依靠高效液相色谱保留时间对法夫酵母JMU-MVP14菌体中类
胡萝卜素进行定性带来不便。

由于氧化镁柱对类胡萝卜素的分离是根据类胡萝卜素分子中的双键数目以及双键位置的不同进行分离的，与硅胶柱以及ODS柱基于极性进行分离的原理形成补充，通过硅胶柱色谱和氧化镁柱色谱相结合的方法，可以将法夫酵母JMU-MVP14菌体中的类胡萝卜素成分很好地分离开来。

本文利用高
效液相色谱对总提取物中的类胡萝卜素分析，仅检测到7种类胡萝卜素成分。

用
硅胶柱和氧化镁柱相结合的方法对总提取物中的类胡萝卜素分析，得到9种单一
的类胡萝卜素成分，获得了较好的分离纯化效果，便于下一步利用波谱技术对得到
的类胡萝卜素成分进行定性。

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