2019年酶工程研究和酶工程产业的新进展Ⅰ——国际酶工程研究领域的若干.doc

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食品与发酵工业 FoodandFer~emationIndustries Vo1．26 No．3
酶工程研究和酶工程产业的新进展【I】
——国际酶工程研究领域的若干“热点”和前沿课题
}|f【，一居乃琥 T 9
(冠生圃(集团)有限公司+200050，上海)
摘要概要舟绍了国际上酶T-程研竞和蓐工程产业的新进展。

第一部分着重介绍国际酶
工程研究领域的若干“搏点”和前沿谭题，包括基因T-程和蛋白质T-程，人T-台成酶和模拟酶，
桉畦酶和抗体霹，酶的定向固定化技术，醇化学技术+非水酶学，糖生物学和糖基转移酶．酶标
药物，极端环境微生物和不可培养微生物的新蓐种，酶在环境保护方面的应用等。

关键词宪必盟塑／、工信每
酶工程是生物技术的一个重要组成部基因工程在酶工程领域的成功应用，可
分。

酶工程是指在一定的生物反应器内，利以算做近年来酶工程最引人注目的发展之
用酶的催化作用，进行物质转化的技术。

其一。

有关文献如雨后春笋，大量涌现。

运用
应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、基因工程技术可以改善原有酶的各种性能，
环境保护、能源开发和生命科学理论研究等如提高酶的产率、增加酶的稳定性、使其在后
各个方面。

与此同时，酶工程产业也在快速提取工艺和应用过程更容易操作等。

运用基
发展。

1998年全世界工业酶制剂销售额高因工程技术也可以将原来由有害的、未经批
达 16亿美元。

预计到2008年，销售额将达准的微生物产生的酶的基因，或由生长缓慢
到30亿美元。

的、动植物产生的酶的基因．克隆到安全的、
近年来．美国、欧洲共同体国家和日本，生长迅速的、产量很高的微生物体内，改由微
在酶工程研究和酶工程产业方面发展非常迅生物来生产。

运用基因工程技术还可以通过
速，仍然居于领先地位。

我们一定要迎接21 增加编码该酶的基因的拷贝数。

来提高微生
世纪知识经济时代的挑战，紧紧跟踪国际上物产生的酶的数量。

这一原理已成功地用于
最新发展动向，本着“有所为，有所不为”的原提高大肠杆菌 (E．coli)青霉素G酰胺酶的
则，明确研究方向，制定发展计划，才能在人产量。

目前，世界上最大的工业酶制剂生产
力、物力、财力都很有限的情况下。

使我国的厂商丹麦诺和诺藩公司(NovoNordisk)，生
酶工程研究和酶工程产业取得更快的发展。

产酶制剂的菌种约有8O％是基因工程菌。

为此，笔者根据个人的一些认识和体会，就国由基因工程发展起来的蛋白质工程，更
际酶工程研究和国内外酶工程产业的现状、加吸引人们的广泛关注。

在蛋白质工程兴起
发展趋势及对策和建议，作一概述。

之初，主要采用定点突变技术，对天然酶蛋白
进行改造，已经取得很多成果。

例如，将近年来，国际上酶工程研究进展迅速，硬
溶菌酶的第51位苏氮酸转变成脯氮酸。

使该果累累。

主要表现在 1O个“热点”和前沿课
酶对ATP的亲和力增强，酶活力提高了25 题方面。

现分述如下。

倍。

但定点突变技术只能对天然酶蛋白中某
1 基因工程(geneticengineering)和蛋些氮基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构
白质 ~(proteinengineering)[ 。

] 基本维持不变．因此对酶的功能的改造非常
*作者：冠生同公司原总工程师。

教授级高级工程师。

现任德国医药创新中心股份有限公司高级顾可『。

井任该公司上海
代表处副首席代表。

收稿时间：2000—02—25}改回时间：2000—03一l5
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第26卷第3期居乃琥：酶工程研究和酶工程产业的新进展(I) 55
有限。

不过，如果通过多代遗传将突变积累
起来，也可以较好地拓展酶的功能。

近来，
Arnold利用所谓“定向酶进化”技术，在试管
中模拟达尔文进化论的关键过程。

先进行无
序突变和重组，继而进行筛选，再通过多代遗
传，可以大大改进和拓展酶的功能。

近来国际上又提出蛋白质全新设计
(proteindenovodesign)的概念。

众所周知，
蛋白质的空间结构由其氨基酸的序列控制，图1 蛋白质全新设
计过程
而其功能又与结构密切有关。

据计算，300 (synzymes)。

人工合成酶在结构上必须具有
个氨基酸可以组成 100种不同序列的蛋白 2个特殊部位，即一个是底物结合位点，一个
质。

而从生物出现以来，自然界只发现过是催化位点。

业已发现，构建底物结合位点
10”种蛋白质。

即绝大多数新序列和新功能比较容易，而构建催化位点比较困难。

2个
的蛋白质或酶，在3O亿a的生物进化过程中位点可以分开设计。

但是已经发现，如果人
还没有出现。

这就有待我们去开发和创造。

工合成酶有一个反应过渡态的结合位点，则
基因工程的飞速发展为蛋白质序列的表达提该位点常常会同时具有结合位点和催化位点
供了强有力的手段。

如果我们能够找到组建的功能。

人工合成酶通常也遵循 Michaelis-
蛋白质结构的方法，就能够获得自然界原先 Menten方程。

例如。

高分子聚合物聚．4．乙
并不存在的、具有全新结构和功能的蛋白质。

烯基吡啶．烷化物，具有麋蛋白酶的功能，含
同样，这一项新技术也可以用于组建自然界辅基或不含辅基的高分子聚合物，具有氧化
原先并不存在的、结构和功能全新的酶蛋白。

还原酶、参与光合作用的酶和各种水解酶等
蛋白质全新设计的过程大致如下：在确定设功能。

计目标后，先根据一定规则产生初始序列，经在模拟酶方面，固氮酶的模拟最令人瞩
过结构预测和构建模型，对序列进行初步的目。

人们从天然固氮酶由铁蛋白和铁钼蛋白
修改，然后进行基因表达或多肤合成，再经结 2种成分组成得到启发，提出了多种固氨酶
构检测，确定是否与原定目标相符，并根据检模型。

如过渡金属 (铁、钴、镍等)的氮络合
测结果．指导进一步的设计。

通常，要完成一物，过渡金属(钒、钛等)的氮化物，石墨络合
个蛋白质的全新设计，都要经过反复多次设物，过渡金属的氨基酸络合物等。

此外，利用
计一基因表达或合成一检测一再设计的过铜、铁、钴等金属的络合物，可以模拟过氧化
程。

尽管目前对蛋白质全新设计的理论基氢酶等。

础，即蛋白质折叠规律的认识还不够深入，蛋近来，国际上又发展起一种分子压印
白质全新设计还处在探索阶段，但是，其应用 (molecularimprinting)技术，又称为生物压印
前景非常诱人，值得深入探索和研究。

(bi。

imprinting)技术。

该技术可以借助模板
在高分子物质上形成特异的识别位点和催化
2 人工合成酶 (synzymes)和模拟酶
位点。

目前．此项技术已经获得广泛的应用。

(elazymemimics)【6·11～3j
例如，模拟酶可用于催化反应，分子压印的聚
酶的高度催化活性以及酶在工业上应用合物可用作特制的分离材料，抗体和受体结
带来的巨大经济效益，促使人们研究人工合合位点的模拟物可用于识别和检测系统，分
成的酶型催化剂。

通常．人们将人工合成的子压印的聚合物可用作生物传感器的识别单
具有类似酶活性的高聚物称之为人工合成酶元等。

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近年来，人们越来越重视氧化还原酶在工台成酶。

而在使用有机溶剂和各种各样底
科学研究和工业方面的应用。

氧化还原酶在物方面，人工台成酶要比天然酶优越得多。

工业上应用的2个最大困难是辅助因子的再
3 核酸酶 (ribozyme)和抗体酶
生，以及底物和产物在水中的溶解度太低。

(abzyme)[ ，～ ]
人工台成酶在氧化还原反应方面的进展，有
可能解决这2个难题。

Wandrey在第 14届近年来，人们发现除去蛋白质具有酶的
国际酶工程会议上所作的主旨演讲中，介绍催化功能以外，RNA和 DNA 也具有催化功
了这方面的研究成果。

他将天然酶和人工合能。

1982年Cech发现四膜虫的26SrRNAd
成酶置于膜反应器内，比较了二者在连续氧的前体，在没有蛋白质存在的情况下，能够进
化还原反应系统中的反应能力(见表 1)。

天行内含子的自我剪接，形成成熟的rRNA，证
然酶的转换频率(turnoverfrequency．TOF) 明RNA分子具有催化功能，并将其称为核
迄今为止仍然高于人工台成酶。

如果把反复酸酶 (ribozyme，有人译为核酶)。

1995年
使用中酶的失活或酶活力的损失考虑在内， Cuenoud又发现某些DNA分子也具有催化
天然酶的平均总转换数(totalturnovernum—功能。

这就改变了只有蛋白质才能有催化功
ber，TTN)也高于人工合成酶。

可以预期，能的传统观念，也为先有核酸，后有蛋白质，
由于人工台成酶反复使用技术的改进，二者提供了进化的证据。

之间对催化剂而言的总酶变数的区别将会降进一步的研究发现核酸酶是一种多功能
低。

随着辅助因子价格的降低和再生技术的的生物催化剂．不仅可以作用于 RNA和
改进，天然酶的辅助因子再生问题在某些情 DNA，而且还可以作用于多糖、氨基酸酯等
况下已经解决。

而对人工合成酶而言，通常底物。

核酸酶还可以同时具有信使编码功能
并不存在辅助因子的再生问题。

但是，辅助和催化功能，实现遗传信息的复制、转录和翻
底物的成本可能成为问题。

天然酶可以利用译，是生命进化过程中最简单、最经济、最原
非常廉价的氢源(氢气、甲酸、葡萄糖等)，而始的、催化核酸自身复制和加工的方式。

核
人工台成酶常常要依靠更昂贵的氢源(如甲酸酶具有核苷酸序列的高度特异性。

这种特
硼烷等)。

而人工合成酶的空间时问产率异性使核酸酶具有很大的应用价值。

只要知
(space-timeyield，STY)，可以大大高于天然道某种核酸的核苷酸序列，就可以设计并台
酶催化的反应。

这一结果的原因是，在膜反成出催化其自我切割和断裂的核酸酶。

我们
应器内，人工合成酶的“活性中心”的浓度能知道，动植物病毒的基因组由核酸组成。

根
够达到非常之高。

这样就可以补偿了转换频据这些基因组的全部序列，就可设计并合成
率低的缺点。

至于对映体过剩 (enantiomeric 出防治有这些病毒引起的人、畜和植物病毒
excess，ee)，天然酶在大多数情况下，优于人病的核酸酶．如能够防治流感、肝炎、艾滋病
寰1 天然酶和人工合成酶催化连续和烟草花叶病等。

核酸酶也可用来治疗某
氧化还原反应的比较些遗传病和癌症。

核酸酶还可以用作研究核
天然酵人工台成酶酸图谱和基因表达的工具。

转换频率 T【OF,叽n ) 10o～2D∞ 1—10
一般说来，人工合成的模拟酶与天然酶
邑转换数(T丁N．对催化剂而百) 达到2×10 达到5×10
总转换数(对辅助固子而言) 达到6×1o5 —的催化效率相差较大．而且，反应类型大都为
空间时间产率(STYk吕(L·d) ) 0．05—05 05～1．0 水解反应。

人们从酶与底物过渡态中间物紧
对映体芷剩( ％) 经常太于99％达到96％
密结台是酶催化过程中的关键一步得到启
普荆水有机涪荆
底物范匿秧窄宽广发，联想到抗原引起生物体内抗体的合成，以
及抗原和抗体的紧密结台。

进而考虑利用抗
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原抗体相互作用的原理来模拟酶的催化作况下。

酶固定化以后活性部分
失去，甚至全部
用。

人们设想以一些底物过渡态中间物的类失去。

一般认为。

酶活性的
失去是由于酶蛋
似物作为半抗原，诱导合成与其构象互补的白通过几种氨基酸残基在固
定化载体上的附
相应的抗体，试图得到能够催化上述物质进着(attachment)造成的。

这
些氨基酸残基主
行活性反应的酶。

1986年这种努力在实验要有：赖氨酸的e一氨基和N
一末端氨基，半胱
室里获得了成功，为人工合成酶和模拟酶，开氨酸的巯基，天门冬氨酸和
谷氨酸的羧基和
创了一条崭新的途径。

人们将这种具有催化 e末端羧基，酪氨酸的苯甲
基以及组氨酸的
活性的抗体称为抗体酶 (abzyme)。

又称催化眯唑基。

由于酶蛋白多点附着在
载体上，引
抗体 (catalyticantibody)。

抗体酶在本质上起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的
是免疫球蛋白，人们在其易变区赋予了酶的增加(图2A)。

近来，国外的研究者们在探索
催化活性。

抗体是目前已知的最大的多样性酶蛋白的固定化技术方面，已经寻找到几条
体系。

原始抗体大家族有 1×10个结合部不同途径．使酶蛋白能够以有序方式附着在
位，体细胞变异还可以增加 1×10个结合部载体的表面。

实现酶的定向固定化(图2B)。

位抗体有极高的亲和力。

解离常数为10 而使酶活性的损失降低到最小程度。

～ 10I1otol／L，其与抗原结合的结合部位与
酶的结合部位相似，但无催化活性。

抗体酶
则具有较高的催化活性。

翩备抗体酶的方法
主要有诱导法、拷贝法、插入法、化学修饰法
和基因工程法。

定化载体
抗体酶的催化效率远比模拟酶高。

同 }舌性中心
●
时，从原理上讲．只要能找到合适的过渡态类
似物，几乎可以为任何化学反应提供全新的髋强诺墨’藩
蛋白质催化剂——抗体酶。

目前抗体酶催化 t
吲定化载体
的反应．除水解反应外，还能催化合成反应、
交换反应、闭环反应、异构化反应、氧化还原图2 酶蛋白的固定化
反应等。

此外，与模拟酶相比，抗体酶表现出 A．无序固定化：B．定向固定化
一定程度的底物专一性和立体专一性。

业已这种定向固定化技术具有以下一些优
证明，抗体酶可以在体内执行催化功能。

抗点：(1)每一个酶蛋白分子通过其一个特定
体酶的应用前景非常诱人。

抗体酶已经用于的位点以可重复的方式进行固定化；(2)蛋
酶作用机理的研究，手性药物的合成和拆分，白质的定向固定化技术有利于进一步研究蛋
抗癌药物的制备。

目前人们正致力于进一步白质结构；(3)这种固定化技术可以借助一
提高抗体酶的催化效率，期望在深入了解酶个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氯基
的作用机理．以及抗体和酶的结构和功能的酸来实现。

目前，文献中涉及的定向固定化
基础上，能够真正按照人们的意愿，构建出具方法有如下几种。

(1)借助化学方法的位点专
有特定催化活性和专一性的、催化效率高的、一性固定化；(2)磷蛋白的位点专一性固定
能满足各种用途需要的抗体酶。

化；(3)糖蛋白的位点专一性固定化；(4)抗
体(免疫球蛋白)的位点专一性固定化；(5)
4 酶的定向固定化技术[ ，～】
利用基因工程的位点专一性固定化。

这种有
固定化酶在工业、临床、分析和环境保护序的、定向固定化技术已经用于生物芯片、生
等方面有着广泛的应用。

但是，在大多数情物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、
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亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究。

酶反应通常在水为介质的系统中进行。

但是，酶反应也能在非水系统内进行。

1984
5 酶化学技术 (chemzymetechnolo—
年以来，美国麻省理工学院以 zals【和
gy)[～·。

～ ]
Klibanov教授为首的研究小组，一直从事非
有机合成是一项非常重要的技术。

它不水系统内酶反应的研究，取得了引人注目的
仅可以构成其它众多研究领域的基础。

而且成果，并由此产生了一个全新的分支学科
也能够不断研制、开发出各种各样的新产品，——非水酶学。

他们发现这类反应具有如下
以符合经济和社会发展的需要。

然而．有机特点：(1)绝大多数有机化合物在非水系统
合成只有经常不断更新和改进其合成的方内溶解度很高；(2)根据热力学原理．一些在
法，从“经典有机化学技术”中解放出来。

才能水中不可能进行的反应，有可能在非水系统
满足上述要求。

众所周知，由于酶的高效和内进行；(3)与水中相比，非水系统内酶的稳
专一性的催化作用，自然界中的生物能够在定性比较高；(4)从非水系统内回收反应产物
常温、常压等温和条件下．生产出无数的、极比水中容易；(5)在非水系统内酶很容易回收
其复杂的化合物。

近20a来。

随着生物化学和反复使用，不需要进行固定化。

和酶化学的进展．以及基因工程和发酵工程实验结果证明，在几乎没有水的系统内．
的进步，有机化学家们越来越重视利用酶和仍可进行各种酶反应。

佣如，
在含有
微生物细胞来从事化学合成。

取得了丰硕的 0．3mol／L丁酸和0．3mol ／L庚醇的己烷中．
成果，并形成了一个新的研究领域——酶化可以进行脂肪酶催化的酯化反应，2h后酯化
学技术。

率达90％以上。

如果在水中进行酯化反应，
目前，酶在有机合成中研究和应用的范酯化率在0．1％以下。

此外，在非水系统内，
围不断扩大，已经涉及众多类型的化学反应。

还能进行酶催化的酰胺水解、酰基交换、硫酸
例如，C-O键、C．N键、P一0键和C．C键的断根交换和肟水解等反应。

裂和形成．氧化反应，还原反应，异构化反应众所周知．酶不能改变反应的平衡常数(
以及分子重排反应等。

其中在对映体选择性 K )。

但是，利用水一有机溶剂两相系统，可
降价 (enantioseleetivedegradations)、非对映以引起实践上很有用的“表观”K 很大的改
体选择性裂解(diastereoselectievecleavages) 变。

前已述及，在非水系统内酶的稳定性提
和手性化合物的合成等方面．酶显示了巨大高。

水溶性更高、亲水性更强的酶与疏水性
的威力。

而手性化合物的合成和拆分。

更引更强、常常与脂肪和膜结合的酶(如脂肪酶
人注目。

在有机合成中所使用的酶。

涉及水等)相比．稳定性的提高更为明显。

亲水性的
解酶类、氧化还原酶类、裂解酶类、异构酶类酶的活性的完整性和稳定性，似乎取决于微
和转移酶类等类型。

在实际应用中．可以直环境内存在水的薄层，大约几个水分子厚。

接利用天然游离酶。

为了提高酶的稳定性和水的数量非常微少。

每个酶分子需要50～
催化活性，以及使用的方便，也可以利用化学 500个水分子。

酶也可以在几乎完全无水的
修饰酶和固定化酶。

近年来，有关酶在有机合状态下起催化作用。

在这样微小的、不含游
成中研究和应用的专著、手册、工具书大量涌离氢离子的环境中的pH，是无法直接测量和
现，充分表明酶在有机合成中的应用，是酶工程控制的。

然而，酶有一种“记忆”功能。

当酶
从水溶液中向有机溶剂中转移时。

似乎能够
领域—个应该跟踪和发展的重点领域之一。

“记住”，即保留住它最后所处环境中的pH，
以及在该pH中的功能。

如果酶结合的水被
除去．或被易于与水混溶的有机溶剂稀释，则
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酶一般会失去活性。

但是，在不发生失活的了l0％，在经济上也还是可行的。

条件下，只要有极微量的水以及与之有关的俄罗斯莫斯科大学以
Martlnek教授为
水的活度的降低．会大大降低酶热失活的速首的研究组详细研究了酶在水一有机溶剂两
度。

这一现象可以用于绝大多数酶。

例如．相系统中的平衡理论和动力学。

由此发展起
猪胰脏脂肪酶在含有0．02％水的三丁酸甘来的理论也可以用于指导生产实践。

有人已
油酯内，100℃时的半衰期为 12h；当水分为提出在水一有机溶剂两相系统中．利用a一淀粉
0．8％时，半衰期下降到 12min。

而在 100％酶和糖化酶由淀粉生产葡萄糖的方案。

在
的水中，酶将立即失活。

此外．在水。

有机溶 3％聚乙二醇 (PEG20000)和 5％粗的、未
剂两相系统内，水的冰点下降，这样，就可以分级的葡聚糖系统中，底物淀粉部分几乎完
在非常低的温度下，使用对热特别不稳定的全进入下面、更亲水的、富含葡聚糖的下相。

酶。

降低水的活度可以使酶分子更具有刚酶大部分也进入下相。

而在水
解过程中生成
性，这就可能影响到酶的K 和 V 。

在极的葡萄糖却更均匀地分布在两相中。

少量的
端情况下，可能引起酶的催化功能的改变。

糖化酶进入上相，而将进入该相的低聚糖(糊
例如，在水活度低的水．有机溶剂两相系统精)转变成葡萄糖。

从而使上相中葡萄糖的
内，猪胰脏脂肪酶不再能催化转酯基反应。

浓度达到140g／L。

平衡由有机溶剂引起的酶的稳定作用和以往，人们都是从酶的最适pH的水溶
失活作用的最重要的因子+是有机溶剂的极液中回收酶。

然后，将其研詹成粉末。

再分
性。

极性越低的溶剂 (即亲水性强的溶剂)，散在合适的有机溶剂中，制成酶的悬浮液，以
对酶牢固结合水分子所需要的结构的破坏较便在水一有机溶剂两相系统中进行酶的催化
少。

有机溶剂极性的最好的量度是该溶剂在反应。

近来Klibanov为首的研究组又探索
n-辛醇和水中分配系数的对数 (1ogP)。

l 出一种新方法，可以使酶溶解而不是悬浮在
P越高，该溶剂的极性 (亲水性)越低。

进一有机溶剂中。

而且，找到很多能够溶解酶的
步的研究发现，酶在水一有机溶剂两相系统内有机溶剂，并阐明了导致有机溶剂中较高蛋
的催化活性与该溶剂的logP之间表现出明白质浓度的规律。

由此，可以进一步研究溶
显的相关关系呈现出S一形的曲线。

当解在有机溶剂中的天然酶的结构和催化特
logP<2时，酶通常会失活；当logP>4 性。

因而，必将大大拓宽酶在非水系统中的
时，酶活性很少受溶剂的影响。

而当logP在应用范围。

2～4之间时，酶活性的变化就稂难预测。

一近来，核磁共振、x一射线衍射和傅立叶变
些最常用的溶剂，情况也是如此。

例如，氯仿换红外光谱的研究表明，在非水相中，酶分子
的logP为2．2，可能适合于某些酶，但却能结构中a一螺旋含量减少，折叠含量增加，二
对另一些酶产生有害的失活作用。

当然，在级结构的有序性增加，因而，提高了酶的稳定
选择有机溶剂时，还需要考虑溶剂的成本，是性。

目前，非水系统中酶的催化作用已广泛
否易于回收，以及易燃性等。

地用于药物、生物大分子、肽类、手性化合物
有时，即使溶剂的logP很小，又很易于化学中间体和非天然产物等的有机合成，引
与水混溶，其对酶的失活作用也可以由平衡起人们的极大的关注。

常数的改变来补偿。

例如，葡萄糖异构酶可
7 糖生物学(glucobiology)和糖基转移
以在水。

乙醇系统内生产高果糖玉米糖浆。

~-(gluCOsyltransferease)[～
在30℃含8o％乙醇的水中，反应平衡时果糖
的浓度可以提高 l0％，达到∞ (果糖)= 糖类是自然界分布最广的生物分子。

近。