【CN109652325A】整合并分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及应用【专利】

(10)申请公布号 CN 109652325 A (43)申请公布日 2019.04.19
权利要求书1页 说明书6页 序列表21页 附图3页
CN 109652325 A
CN 109652325 A
权 利 要 求 书
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1 .一种δ整合并分泌表达纤维素酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株 RδBEC ,保藏编号CGMCC NO .16825。
(72)发明人 洪解放 张敏华 马媛媛 邹少兰
(74)专利代理机构 天津一同创新知识产权代理 事务所(普通合伙) 12231
代理人 陆艺
(51)Int .Cl . C12N 1/19(2006 .01) C12P 7/10(2006 .01) C12R 1/865(2006 .01)
( 54 )发明 名称 δ整合并分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工
2 .权利要求1的工业菌株RδBEC，保藏编号CGMCC NO .16825在乙醇生产中的应用。
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CN 109652325 A
说 明 书
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δ整合并1] 本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种分泌表达多种纤维素酶的酿 酒酵母工业菌株及应用。
业菌株及应用 ( 57 )摘要
本发明公开了δ整合并分泌表达纤维素酶 的酿酒酵母工业菌株及应用 ,一种δ整合并分泌 表达纤维素酶的 酿酒酵母( Sa ccha romyces cerevisiae )工业菌株RδBEC ,保藏编号CGMCC NO .16825。上术工业菌株RδBEC，保藏编号CGMCC NO .16825在乙醇生产中的应用。本发明的菌株R δBEC，保藏编号CGMCC NO .16825分泌表达5种纤 维素酶 ：瑞氏木霉Trichoderma reesei CBH1、 CBH2和EG2；棘孢曲霉Aspergillus aculeatus BGL1和CBH1。该菌能协同现有商业化的纤维素酶 高效降解纤维素，提高乙醇产率。
背景技术 [0002] 可再生能源的开发利用是当前人类面临能源、环境和粮食等问题所采取的积极措 施，作为主要生物能源的燃料乙醇由于其独特的车用性质而受到广泛关注。2005-2016年， 全球生物燃料乙醇消费量从3628万吨增加到7915万吨，年均增长7 .3％。目前有超过40个国 家和地区推广生物燃料乙醇和车 用乙醇汽油，年消费乙醇汽油约6亿吨 ，占 全球汽油消费 总 量的60％左右。在我国 ，为满足日益增长的能源需求及改善空气 质量 ，2017年9 月13日国家 发展改革委、国家能源局、财政部等十五部门联合印发了《关于扩大生物燃料乙醇生产和推 广使 用车 用乙 醇汽 油的实施方案》，将按照“严控总量 ，多元发展”等基本原则 ，适度发展粮 食燃料乙醇 ，科学合理把握粮食燃料乙醇总量，大力发展纤维素燃料乙醇。根据规划，到 2020年 在全国 基本实现乙 醇 汽 油全覆盖。据估计 ，到 20 20年我国 燃料乙 醇 利 用量 将达到 1570万吨 ，按目前我国乙醇供应能力 ，产能缺口 约为1275万吨/年。另一方面 ，我国每年可利 用的秸秆和林业废弃物超过4亿吨 ，若30％被利用，可生产燃料乙醇2000万吨。高效、低成本 利用木质纤维素生产燃料乙醇是生物燃料技术发展的趋势。 [0003] 目前利用木质纤维素生物转化生产燃料乙醇的主要障碍是缺乏一种低成本降解 木质纤维素的技术：木质纤维素乙醇用酶量是淀粉乙醇用酶量的30-50倍，纤维素酶的成本 占 总成 本的 2 0 ％ - 3 0 ％ 。将纤 维 素 酶 生 产 、水 解 和发 酵 组 合 在 一 起的 统 合 生 物 工 艺 (consolidated bioprocessing，CBP)因能降低水解和发酵成本而被认为是一种有应用前 景的技术。该技术的关键是构建一种能有效降解纤维素类多糖成发酵糖并发酵产醇的微生 物。在酿酒酵母中表达纤维素酶 ，使之具有利 用纤维素发酵生产乙 醇的能 力即是其中的 一 种策略。 [0004] 经过多年研究，各种各样的纤维素酶在酿酒酵母中已成功实现表达，但研究多数 是 在酿 酒 酵 母实 验 室 菌 株中 进 行的 ，而 在 工 业 菌 株中的 研究 还 较 少。K h ra m ts o v 等 (Khramtsov N ,et al .Industrial yeast strain engineered to ferment ethanol from ligocellulosic biomass .Bioresource Technology ,2011 ,102(17):8310-8313)采用δ整 合策略和rDNA同源重组技术在酿酒酵母工业菌株之衍生菌株染色体上整合了三种纤维素 酶基因(Trichoderma reesei cbh2、egl2和Aspergillus aculeatus bgl1)，采用96孔板大 通量筛选，得到的最佳菌株发酵10％预处理过的玉米秸秆，96h乙醇浓度达到2 .6％(v/v)。 重组菌株构建中使用G418抗性筛选标记 ，在重组菌中该标记不易去除 ，使其难以 多次使用； 田沈和杨秀山 (田沈 ,杨秀山 .利用展示纤维素酶的酿酒酵母菌群发酵生产乙醇的方法 .CN104673689A)在酿酒酵母工业菌株上分别表面展示表达Trichoderma reesei cbh2、 egl2和Aspergillus aculeatus bgl1，得到三个重组菌株，将它们诱导培养后按2:1:1的比 例混合后 用于纤维素统合生物加工中。重组菌株是一混合菌群 ，各菌株之间的比 例极易受
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910023371 .4
(22)申请日 2019 .01 .10
( 83 )生物保藏信息 CGMCC No .16825 2018 .11 .26
(71)申请人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路92号