表面活性素对粗毛栓菌富集和吸附铬影响的研究

表面活性素对粗毛栓菌富集和吸附铬影响的研究
杨柳;吴俊贤;孙丹宇;刘国庆
【摘要】文章为探明表面活性素促进粗毛栓菌D2富集/吸附铬的可能原因,对表面活性素浓度对粗毛栓菌D2富集/吸附铬的影响进行了研究,并分析了表面活性素与铬的配合反应、表面活性素对粗毛栓菌细胞通透性的影响.实验结果表明:当表面活性素浓度为0.20 mmol/L时,粗毛栓菌D2富集/吸附Cr(Ⅲ)的量达到最大,比对照样(无表面活性素)分别增加了817.73％(富集)和152.18％(吸附);当表面活性素浓度为0.40 mmol/L时,粗毛栓菌D2富集/吸附Cr(Ⅵ)的量比对照样分别增加了558.65％(富集)和222.22％(吸附).配合实验表明,表面活性素能与铬形成溶解度较低的配合物,降低了溶液中的铬离子浓度;表面活性素能够增加粗毛栓菌细胞通透性,促进细胞对金属离子的吸收.表面活性素促进粗毛栓菌富集/吸附Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的主要原因是其能够增加细胞通透性.
【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(042)005
【总页数】6页(P696-701)
【关键词】粗毛栓菌;表面活性素;富集;吸附;细胞通透性;配合作用
【作者】杨柳;吴俊贤;孙丹宇;刘国庆
【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥 230009
【正文语种】中文
【中图分类】Q819
铬及其化合物被广泛应用在冶金、电镀、制革、印染等行业中,含铬废水的不达标排放及铬渣的处理不当常导致地下水、土壤等被铬污染,因铬及其化合物在环境中不能被降解且对生物有毒性,铬污染日益受到重视。

吸附法因具有高效、成本低廉及环境友好等优点而被广泛使用在含铬废水的治理中[1-2],其中生物吸附法因具有操作简捷、选择性好等优点而受到关注[3]。

生物吸附剂包括微生物、藻类、农林废弃物等。

常用微生物吸附剂有木霉、曲霉、根霉、酵母等,如棘孢木霉TS141对溶液中的铅离子、镍离子富集能力较强,在Pb(Ⅱ)质量浓度为100 mg/L时能去除68.4%的铅离子,在Ni(Ⅱ)质量浓度为200 mg/L时能去除78.0%的镍离子;哈茨木霉TS103对镉离子的富集能力较强,在Cd(Ⅱ)质量浓度为200 mg/L时能去除溶液中82.1%的镉离子[4];Cr(Ⅵ)质量浓度为100 mg/L时,黑曲霉Ed8在鼓泡塔反应器中吸附铬,每克干菌体能吸附2.62 mg铬[5]。

在处理重金属污染的土壤、污泥时,发现一些表面活性剂，如鼠李糖脂、皂角苷、槐糖脂等,能提高铜、锌、铬、镍、铅、锰、铁等金属的去除率[6]。

本研究利用粗毛栓菌对铬进行富集和吸附,富集是在菌体生长过程中添加铬化合物,利用其生长代谢活动使铬沉积在细胞内或细胞表面;吸附是在含铬溶液中添加一定量的菌体,以菌体为吸附剂直接吸附铬离子。

前期研究发现粗毛栓菌(Trametes gallic)D2对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)具有较强的耐受性,且对铬有较强的富集和吸附能力。

在研究表面活性剂对粗毛栓菌富集/吸附铬的影响时,发现表面活性素能显著促进粗毛栓菌对铬的富集/吸附。

表面活性素(surfactin)是枯草芽孢杆菌的次级代谢产物,是由C13-C15羟基脂肪酸形成内酯环系统的七肽环(L-Glu—L-Leu—D-Leu—L-
Val—L-Asp—D-Leu—L-Leu)构成的脂肽化合物。

表面活性素因其表面活性强、环境危害小等优点被广泛应用在农业、化工及医药等行业[7]。

表面活性素对真菌富集/吸附金属影响的报道并不多,本文从表面活性素与铬离子的配合作用和对粗毛栓菌细胞通透性的影响2个方面对表面活性素促进粗毛栓菌富集/吸附铬原因进行分析,以期为真菌在含金属离子的废水处理中的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法
1.1 材料
粗毛栓菌(Trametes gallic)D2,贮藏于合肥工业大学微生物资源与应用研究室。

表面活性素(钠)(商品名:莎梵婷,纯度≥85%)由安徽帝元生物科技有限公司提供,简称“表面活性素”。

1.2 铬的测定方法
二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr(Ⅵ)的量;高锰酸钾氧化-二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr(Ⅲ)[8]。

1.3 菌体对铬的富集
向马铃薯蔗糖(PDA)液体培养基中加入CrCl3·6H2O溶液使其在培养基中的终浓度为3 mmol/L(或K2Cr2O7的终浓度为0.3 mmol/L),添加表面活性素溶液使其终浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L,1×105 Pa 灭菌20 min。

打孔器接种直径8 mm的菌块于装有100 mL培养基的250 mL三角瓶中,30 ℃、14～150 r/min 下培养4 d。

抽滤发酵液获得菌体,蒸馏水洗涤菌体3次,85 ℃烘干称重。

1.4 菌体对铬的吸附
接种菌体于PDA液体培养基中,140～150 r/min、30 ℃下培养4 d。

抽滤发酵液获得菌体,蒸馏水洗涤菌体3次。

准确称取湿菌体1 g于装有100 mL 3 mmol/L CrCl3·6H2O的0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH值为6.0±0.1)溶液(或0.3
mmol/L K2Cr2O7溶液)的三角瓶中,加入表面活性素使其最终浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L,在30 ℃ 14～150 r/min振荡吸附2 h。

蒸馏水洗涤菌体、烘干菌体、测定菌体中铬的量。

1.5 电镜样品制作
表面活性素处理后的含铬菌体经超纯水洗涤,4%戊二醛4 ℃固定12 h,1%锇酸4 ℃固定1 h,30%～100%乙醇梯度脱水,真空低温干燥后喷金上镜[9]。

1.6 表面活性素与铬的配合反应
分别配制浓度为0、0.1、0.5、0.8、1.0 mmol/L的表面活性素溶液50 mL,在各
浓度的表面活性素溶液中加入CrCl3·6H2O,使CrCl3·6H2O终浓度为0.5、2.0、3.0、4.0 mmol/L。

50～60 r/min振荡反应30 min。

反应液经离心及0.22 μm
滤膜过滤,测定滤液中Cr(Ⅲ)的量。

1.7 细胞通透性的测定
将培养4 d的培养液抽滤后获得菌体,用重蒸水洗涤菌体2～3次备用。

取湿菌体1 g分别与不同浓度(0、0.05、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmol/L)的表面活
性素溶液混合,25 ℃振荡60 min(11～120 r/min),使用电导率仪分别测定0、60 min及死处理(煮沸10 min)的电导率,每个浓度重复3次,以重蒸水作对照,计算细
胞的相对通透性,具体公式如下:
通过率=(C1-C0)/C死处理×100%
(1)
其中,C1为60 min时的电导率;C0为初始(0 min)时的电导率;C死处理为死处理后的电导率。

2 结果与分析
2.1 表面活性素浓度对粗毛栓菌富铬的影响
前期实验表明粗毛栓菌D2在1.0～5.0 mmol/L CrCl3·6H2O溶液和0.10～0.35
mmol/L K2Cr2O7溶液生长良好。

选择3.0 mmol/L CrCl3·6H2O溶液和0.30 mmol/L K2Cr2O7溶液进行粗毛栓菌富铬实验。

分别向含Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的PDA 液体培养基中加入不同浓度的表面活性素,培养4 d后,测定生物量(干重)和胞内铬
的量,结果如图1所示。

图1 表面活性素浓度对粗毛栓菌D2富集铬的影响
从图1可以看出,较低浓度的表面活性素(≤0.4 mmol/L)有助于缓解Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)对菌体生长的胁迫从而促进菌体生长,而较高浓度的表面活性素(>0.4 mmol/L)抑
制菌体生长。

实验中发现高浓度表面活性素条件下粗毛栓菌菌丝球较小,直径为
0.3～0.4 mm,而无表面活性素的条件下菌丝球直径为0.8～1.0 mm。

粗毛栓菌在Cr(Ⅵ)存在条件下生物量较低,这主要是由于六价铬化合物进入细胞并转化为三价铬的过程中产生的五价铬中间体和活性氧对细胞DNA有损伤[10],抑制了菌体的生长。

从图1可知,一定浓度的表面活性素能提高粗毛栓菌D2对铬的富集。

以3.0
mmol/L CrCl3·6H2O为铬源,当表面活性素浓度为0.20 mmol/L时,菌体对铬富集量达到最大,为3.313 mmol/g,比对照样(无表面活性素)增加了817.73%。

以0.30 mmol/L K2Cr2O7为铬源,当表面活性素浓度为0.40 mmol/L时,菌体对铬富集量
最大为0.92 mmol/g,较对照样增加了558.65%。

2.2 表面活性素浓度对粗毛栓菌吸附铬的影响
分别向含Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液中加入菌体及不同浓度的表面活性素,振荡吸附2 h,
测细胞中铬的吸附量,结果如图2所示。

图2 表面活性素浓度对粗毛栓菌D2吸附铬的影响
从图2可知,随着表面活性素浓度提高,粗毛栓菌吸附Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的量均出现先
升高后降低的过程。

从图2a可知,表面活性素浓度为0.2 mmol/L时,粗毛栓菌对
Cr(Ⅲ)的吸附比对照样提高了152.18%。

这与图1最佳富集浓度相一致。

粗毛栓
菌对Cr(Ⅵ)的吸附量则在表面活性素浓度为0.4 mmol/L时达到峰值,比对照样提
高222.22%(如图2b)。

从图1、图2可以看出,表面活性素对粗毛栓菌富集和吸附铬具有显著的促进作用,
为了弄清这种促进作用的可能原因,需要从表面活性素与铬化合物的相互作用以及
表面活性素对菌体性质的影响2个方面进行分析。

2.3 表面活性素和Cr(Ⅲ)的配合反应
国内外研究[11-12]表明,生物表面活性剂可与金属离子形成可溶性或溶解度较低的配合物。

若表面活性素与铬离子形成难溶性的配合物,则会降低溶液中铬离子含量,
虽然能减轻铬对菌体的胁迫,但是可能会降低细胞对铬的富集或吸附。

若表面活性
素与铬离子形成可溶性配合物,则需要研究配合物对菌体生长及对富集/吸附的作用。

表面活性素与Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)的配合反应类似,本文以表面活性素与CrCl3·6H2O
为例进行配合分析。

分别在不同浓度的CrCl3·6H2O溶液中加入表面活性素,反应30 min后,反应液经膜过滤后,测定滤液中剩余Cr(Ⅲ)的浓度,结果如图3所示。

图3 表面活性素浓度对溶液中Cr(Ⅲ)量的影响
从图3可以看出,向CrCl3溶液加入表面活性素,能大大降低溶液中Cr(Ⅲ)浓度;在所研究的CrCl3浓度范围内,当表面活性素浓度高于0.1 mmol/L时,随表面活性素浓
度增加,溶液中的Cr(Ⅲ)浓度降低不明显,可以认为表面活性素浓度高于0.1
mmol/L时配合反应体系基本达到平衡。

从图3结果推测出，在菌体吸附或富集
铬的过程中,添加表面活性素能降低溶液中铬离子浓度。

环境中铬离子浓度会影响
到细胞富集或吸附铬的能力,如图4所示。

Cr(Ⅲ)浓度在0～2 mmol/L 内,细胞中
铬的量随Cr(Ⅲ)浓度增加而增加。

图4 溶液中铬浓度对粗毛栓菌富集和吸附铬的影响
对于吸附过程,Cr(Ⅲ)浓度大于2 mmol/L时,细胞中铬的量趋于稳定,不随Cr(Ⅲ)浓
度增加而增加;对于富集过程,Cr(Ⅲ)浓度大于2 mmol/L时,由于Cr(Ⅲ)对细胞毒害
作用,细胞中铬的量随Cr(Ⅲ)浓度增加而减小。

通过以上分析可知,表面活性素与Cr(Ⅲ)能形成溶解度较低的配合物,不仅不会提高细胞对铬富集(或吸附)的能力,反而会降低细胞对铬富集(或吸附)。

但溶液中铬离子浓度若因其他原因降低,则配合物溶液会因动态平衡,能保持铬离子浓度相对稳定。

2.4 表面活性素对膜通透性的影响
表面活性剂可以提高脂质、固醇、氧等疏水性物质的溶解度,促进细胞的同化作用,有利于细胞的生长[13-14]。

在铬离子进入细胞过程中,细胞膜是重要屏障,铬离子进入细胞的效率很低[10]。

考虑到表面活性素对无细胞生长的吸附过程有显著的促进作用,研究了表面活性素浓度对粗毛栓菌D2细胞通透性的影响,结果如图5所示。

图5 表面活性素对粗毛栓菌D2细胞通过率影响
从图5可知,粗毛栓菌的通过率随表面活性素浓度的增加而显著增加,0.2 mmol/L 表面活性素浓度下细胞通透性比对照样增加了68.37%,1.0 mmol/L表面活性素浓度下细胞通透性比对照样增加了192.67%。

细胞通透性的提高有助于促进铬离子的跨膜运输,铬离子更易进入细胞,但过高的细胞通透性会导致胞内核酸、蛋白质等外泄,从而造成细胞损伤。

图1中,高浓度的表面活性素(>0.4 mmol/L)作用下,粗毛栓菌D2的生长受到抑制,表面活性素1 mmol/L下生物量比对照样减少了26.5%。

经1 mmol/L表面活性素处理粗毛栓菌的扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)照片如图6所示。

图6 表面活性素处理后粗毛栓菌D2表面的SEM图像
从图6可以很明显地观察到细胞表面的损伤严重,细胞表面结构变得不均匀,出现褶皱、龟裂,细胞膜和细胞壁不再完整。

粗毛栓菌膜结构的破坏会造成细胞质外流,细胞正常的生命代谢活动受限制,造成生物量和富铬量降低。

3 结论
(1)分别以CrCl3·6H2O和K2Cr2O7为铬源时,0.1～1.0 mmol/L的表面活性素能提高粗毛栓菌D2对铬的富集和吸附,部分去除溶液中的铬离子,0.1～0.8 mmol/L
的表面活性素能促进粗毛栓菌D2的生长。

(2)在CrCl3溶液中,加入表面活性素能显著降低溶液中Cr(Ⅲ)浓度,Cr(Ⅲ)浓度随表
面活性素浓度的增加而降低,根据表面活性素的化学结构,推测表面活性素能与
Cr3+形成难溶的配合物。

(3)CrCl3浓度在0.1～1.0 mmol/L时,粗毛栓菌D2对铬的富集和吸附能力随
Cr(Ⅲ)浓度增加而增加。

(4)在含粗毛栓菌D2的体系中加入表面活性素,能增加该菌的细胞通透性,说明表面活性素能提高该菌对物质的吸收能力,但过高浓度的表面活性素会导致菌体损伤严重。

(5)表面活性素能提高粗毛栓菌D2对铬的富集和吸附，主要原因是其能有效提高
细胞的通透性,从而能除去溶液中的含铬化合物。

近年来,国家对于重金属排放标准逐年严格。

尽管去除废水中重金属的处理方法很多,但单一处理技术很难达到排放水平,因此常使用组合方法处理废水。

粗毛栓菌是
漆酶的主要生产菌,对营养条件和环境条件要求不高[15],在工业上已有广泛应用。

粗毛栓菌D2在0～250 mg/L Cr(Ⅲ)和0～36 mg/L Cr(Ⅵ)条件下生长良好,并对
铬具有良好的富集和吸附作用,研究中还发现粗毛栓菌D2对Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Cd2+等也具有富集或吸附作用。

因此粗毛栓菌D2可在化学处理高浓度
重金属废水之后的二次处理中使用。

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