DNA连接2

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ssb对dna二级结构

ssb对dna二级结构
DNA的二级结构是指DNA分子中两条螺旋状的链之间的结构。

单链DNA具有一定的二级结构，而双链DNA则形成了经典的双螺旋结构。

而SSB（Single-Strand Binding）蛋白则在DNA复制和修复过程中发挥着重要的作用。

SSB蛋白是一种结构特殊的蛋白质，它的主要功能是在DNA复制和修复过程中保护单链DNA，防止其形成二级结构或被降解。

在DNA复制过程中，双链DNA需要被解开成两条单链DNA，而这些单链DNA容易形成二级结构，影响DNA复制的进行。

SSB蛋白的作用就是结合在单链DNA上，阻止其形成二级结构，保持DNA的单链状态，为DNA复制酶提供一个稳定的模板。

此外，SSB蛋白还在DNA损伤修复过程中发挥作用。

当DNA受到损伤时，会产生单链断裂或者缺失，这时SSB蛋白会结合在损伤的单链DNA上，保护其不被降解，并且为DNA修复酶提供修复的模板。

总的来说，SSB蛋白在维持DNA的单链状态、防止DNA二级结构的形成以及在DNA损伤修复中发挥着重要作用。

它的存在保证了
DNA复制和修复过程的顺利进行，对维持细胞的遗传稳定性起着重要的作用。

高二生物制作dna双螺旋结构模型

实验十制作DNA双螺旋结构模型一、教材分析本实验既可加深学生对“DNA结构”的感性认识和理解，也可以培养学生的动手能力。

教材首先介绍了该实验的“实验原理”。

从制作DNA模型前应该考虑的问题、制作过程做了详细阐述。

教材接着说明了制作的“目的要求”。

要求通过制作DNA双螺旋结构模型，加深对DNA 分子结理解和认识。

教材第三部分清楚地列出了该实验所需要的“材料用具”。

特别应明白用什么代表磷酸、什么代表糖、什么代表含氮碱基。

以及用什么对它们进行连接。

教材第四部分更为详细地介绍该实验的“方法步骤”。

从制作“基本单位→脱氧核苷酸长链→DNA结构→DNA的空间结构”这一步骤详细地作了说明。

因此，我们从如下几方面对该实验做本质性的准备：1．知识结构的联系：要明确DNA的化学元素是C、H、O、N、P，由它们组成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基，再由1分子磷酸、1分子脱氧核糖和1分子的含氮碱基组成基本单位一—脱氧核苷酸；再由脱通过聚合作用形成DNA分子。

2．掌握该实验的知识点：对理解和掌握“DNA分子的功能（复制和表达)”、“遗传和变异”以及“基因工程”打下了较好的理论基础。

3．实验操作的关键：该实验成败的关键是连接。

二、教学目标1 知识目标①应用：碱基互补配对原则。

②掌握：制作DNA双螺旋结构模型的方法。

2 能力目标通过制作“DNA双螺旋结构模型”培养学生的动手能力。

3 情感目标①通过小组实验，培养学生的合作精神。

②通过实验，培养学生的实事求是精神。

三、重点·实施方案1 重点掌握制作“DNA双螺旋结构模型”的技术。

2 实施方案①对每小组进行关键步骤指导；②对连接方式进行讲解。

四、难点·突破策略1 难点“DNA双螺旋结构模型”的制作。

2 突破策略①板书说明制作的程序和重要环节。

②诱导学生理解各步骤的连接及原理。

五、实验原理DNA分子具有特殊的空间结构一一规则的双螺旋结构，这一结构的主要特点是：(1)DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成。

重叠延伸PCR技术

反应机理
F2 引物 F1 引物
5’ 3’ 3’ 5’
基因B
5’ 3’
R2 引物
3’ 5’
基因A
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R1引物
加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链，退火——单链模板结合
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 加入F1引物、R2引物
5’ 3’
5’
3’
无目标产物
5’ 3’
F1 引物
3’ 5’
R2 引物
重叠延伸PCR技术
（SOE PCR）
1. 重叠延伸PCR技术的概念
• 重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
答案：（1）越高（2）引物2和引物3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用（3）3 （4）2 （5）目的基因与载体结合将重组DNA导入受体细胞
解析：重叠延伸PCR技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面有广泛的应用。老师要予以关注，在讲评中可适当拓展。G 与C碱基对之间是三个氢键，引物中G—C含量越多，越稳定。由图可知，因为引物 2、3有互补片段，但引物1、4没有互补片段。利用引物1、2进行扩增，可产生两种DNA片段，利用引物3、4进行扩增，可产生，其中a、c 分别是以引物1和引物4扩增产生的DNA片段，是相同的DNA片段，b、d分别是以引物2和引物3扩增的DNA片段，碱基序列是不同的，共三种。因为新的核苷酸链必须从5′端到3′端，在第二阶段，含引物1和引物4的脱氧核苷酸链因为有互补的碱基序列，而部分互补，并能互为模板进行延伸，但含引物2和引物3的脱氧核苷酸链虽能部分互补，但因方向问题，不能延伸。

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。

Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。

Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。

染色体与DNA2

？
B-DNA的变化情况：
＊ DNA在水溶液中, 构型偏B型状态＊ DNA以10 bp/helix为最稳定构型＊小于10bp/helix 向正超螺旋发展(紧缠态)
＊大于10bp/helix 向负超螺旋发展(松缠态)
天然的DNA都存在负超螺旋但一些生命活动过程中存在正超螺旋
二、超螺旋状态的描述
胞嘧啶核苷酸（CMP）
尿嘧啶核苷酸（UMP）
二、DNA的一级结构 1、四种脱氧核糖核苷酸脱氧核糖的5’位和与其相邻的戊糖的3’位之间由3’,5’磷酸二酯键连接。核酸由具有方向性的糖-磷酸骨架及结合于糖分子1’位的碱基构成。磷酸带负电，因此核酸是具有强负电性的多聚大分子。
3’ 5’
DNA、RNA的一级结构
3、一级结构的功能指DNA分子中的碱基排列顺序
贮存遗传信息
决定DNA的高级结构
DNA的二级结构
* 1953.
Watson & Crick提出
右手 B- DNA Double helix Model
Phosphodiester Backbone
一、双螺旋模型
· 直径2nm · 螺距为3.4nm（任一条链
本节学习重点
• DNA双螺旋结构（主链，侧链和碱基；氢键，碱基堆积力） • DNA一级结构 • DNA二级结构（A-DNA, B-DNA, Z-DNA） • DNA三级结构（L=T+W，拓扑异构酶I和 Ⅱ）
核酸的化学组成
碱基核苷核酸核苷酸磷酸
戊糖
HOCH2 H H
O H
OH H
HOCH2 H H
3、拓扑异构酶的生物学功能 a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋如：复制叉前面正超螺旋的消除转录酶前正超螺旋的消除，后面负超螺旋的产生 b、防止细胞DNA的过度超螺旋

人教版高二生物选修三知识点总结：专题二细胞工程

选修3《现代生物科技专题》知识点总结专题2 细胞工程（一）植物细胞工程1.植物组织培养技术（1）原理：植物细胞的全能性全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞脱分化再分化发育（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织胚状体植物体常用的植物激素生长素和细胞分裂素。

（3）用途：微型繁殖、作物脱毒（选材应该选择茎尖组织）、制造人工种子、单倍体育种（最大的优点是明显缩短育种年限，得到的全为纯种）、筛选突变体、细胞产物的工厂化生产。

（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

2.植物体细胞杂交技术（1）原理：细胞膜的流动性、植物细胞的全能性（2）过程：去壁的方法：酶解法；诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电激等。

化学法是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

（4）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

（2）原理：细胞增殖（3）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（4）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

（5）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。

通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。

此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。

通常需加入血清、血浆等天然成分。

专题9 现代生物科技专题精研重难点(2) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建

(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制一个至多个限制酶切割位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
精研重难点(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
从“高度”上研究高考
[典例] (2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过 PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为__________。
B．NdeⅠ和XbaⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。答案：A
[解析] (1)密码子位于 mRNA 上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于 A 位点和 B 位点的外侧。
(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知， MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体 P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。

【公开课件】DNA的结构+课件高一下学期+生物人教版必修二

双螺旋解开放大
TA GC CG AT GC CG TA GG C
DNA片段的立体结构模式图
DNA片段的平面结构模式图
二、DNA的结构
5'
胸腺嘧啶脱氧核苷酸磷酸二酯键鸟嘌呤脱氧核苷酸
3'
TA GC CG AT GC CG TA GG C
3'
一条脱氧核苷酸链片段
DNA分子中磷酸 = 脱氧核糖 = 含氮碱基
C-G间：3个
单链中相邻碱基：通过脱氧核糖一磷酸一脱氧核糖连接
氢键越多，结合力越强。G和C的含量越多，DNA的结构稳定性越强。
特点：(3)两条链上的碱基通过氢键连
接成碱基对，并且碱基配对具有一定
规律：A一定与T配对，G一定与C配
对。碱基之间的这种一一对应的关系，
叫作碱基互补配对原则。
5'
特点
DNA分子的稳定性
五、巩固练习
2. 书本P52页在含有4种碱基的DNA片段中，腺嘌呤有a个，占该区段全部碱基的比例为b，则（ C ） A.b≤0.5 B.b≥0.5 C.胞嘧啶为a（1/2b-1）个 D.胞嘧啶为b（1/2b-1）个
预告
制作DNA双螺旋结构模型比赛
时间：半期考后一周材料用具：曲别针、泡沫塑料、纸片、扭扭棒、牙签、橡皮泥、铁丝等常用物品，都可用作模型制作的材料。不可以网上直接购买模型。
腺嘌呤脱氧核苷酸
胸腺嘧啶脱氧核苷酸
鸟嘌呤脱氧核苷酸
胞嘧啶脱氧核苷酸
一、DNA双螺旋结构模型的构建
脱氧核苷酸如何形成DNA分子呢？
一、DNA双螺旋结构模型的构建
资料2： 1951年，波林（1954年诺贝尔化学奖
得主），发现蛋白质的长链结构。由此启发：DNA是由许多个脱氧核苷酸连接而成的长链。

DNA的高级结构

DNA的高级结构（三）DNA的高级结构：（1）1953年Watson与Crick提出的DNA双螺旋结构模型,主要有三方面依据:1.核酸化学结构和核苷酸键长和键角数据。

2.DNA X—射线衍射分析。

3.DNA碱基组成的Chargaff规则；同一物种不同组织和器官，DNA碱基组成具有生物种特异性.且摩尔数为A=T， G=C， A+C=G+T。

（2）DNA二级结构：W-C DNA分子双螺旋结构模型见P480 图13-5，要点如下：1.两条反向平向的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，两条链均为右手螺旋。

2.碱基位于双螺旋内侧，核酸与核糖在外侧，彼此通过3‘，5‘-磷酸二酯键相连接，形成DNA分子骨架。

碱基平面与纵轴重直，糖环平面与纵轴平行。

多核苷酸链方向3‘→5‘为正向（P487 图13-6），形成一条大沟和一条小沟。

3.双螺旋平均直径为2nm,两个相邻碱基对之间相距高度为0.34nm，两核苷酸之间夹角为360，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸，每一转的高度（螺距）为3.4nm。

4.两条链被碱基之间形成的氢键连成一体，互相匹配，A与T配对，形成两个氢键，G与C配对，形成三个氢键.5.碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制，一条链序列确定后则决定另一条互补链序列。

遗传信息由碱基序列所携带。

DNA结构可受环境影响而改变，有A、B、C、D、E和Z型等不同构象存在。

A、B型是DNA基本构象，E型为左手双螺旋。

B型：为W-C双螺旋结构，DNA钠盐在较高湿度下（92%)制得的纤维结构。

A型：螺体较宽而短，RNA分子双螺旋区以及RNA-DNA杂交双链具有与A-DNA相似结构。

P489 表13-6 A、B和Z型DNA的比较.DNA二级结构主要是形成双螺旋，但在某些情况下也能形成三股螺旋，第三股的碱基可与W—C 碱基对中嘌呤碱形成配对。

P489 图13—10三股螺旋DNA碱基配对.H—DNA是通过分子内折叠形成的三股螺旋（P490 图13—11 H—DNA结构）,它存在于基因调控区，因而有重要生物学意义。

cDNA第二链合成

cDNA 第二链的合成
即将上一步形成的mRNA-cDNA 杂合双链变成互补双链cDNA 的过程。

cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。

1．自身引导法：
首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA 链，解离的第一链cDNA 的3'-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA 合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），并引导DNA 聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。

2.置换合成法：
它是由一组酶共同控制，包括RNA 酶H 、大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ和DNA 连接酶。

mRNA－cDNA 杂合双链中的mRNA 链在RNA 酶H 作用下先形成很多切口，mRNA 链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。

大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ以第一链cDNA 为模板合成一段段互补的cDNA 片段。

这些cDNA 片段进而在DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA 的第二链。

遗留在5'-末端的一段很小的mRNA 也被大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的5'--3' 核酸外切酶和RNA 酶H 降解，暴露出与第一链cDNA 对应的3'-端部分序列。

同时，大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的3'--5' 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA 的3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。

这种方法合成的cDNA 在5'-端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整。

DNA的酶切和DNA片段的链接

DNA的酶切和DNA片段的链接一、实验目的1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立2、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立二、实验原理限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。

DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。

DNA连接酶催化双链DNA 分子中相邻碱基的5’- P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。

一个DNA片段的5’-P 末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。

三、实验器具及试剂1、材料与试剂标准pUC19(2686bp) 、EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液、λDNA/EcoT14 I 、T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液、0.5×TBE电泳缓冲液、6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖2 、器具：水平式电泳装置、电泳仪,台式高速离心机、恒温水浴锅（用PCR仪代理）、微量移液枪、微波炉或电炉、紫外透射仪、照相机及其附件四、实验步骤（一）质粒DNA酶切（1）在200μl 的薄壁离心管中，按照下列加入试剂：无菌水2.5(μl)，质粒10(μl)，酶切缓冲液1.5(μl) ，EcoRI 酶1.0(μl) ，Total15(μl)（2）混匀；点动离心将反应液甩至管底。

37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。

（3）反应结束后， 75℃，保温10min使酶失活。

（4）电泳检测（二）DNA片段的连接（1）取200 μl的离心管按下列加入试剂。

ddH2O6.0(μl)，λDNA/EcoT14(μl)， I片段10.0(μl)，连接缓冲液2.0(μl)， T4DNA连接酶2.0(μl)（2）混匀后点动离心，将溶液甩至管底（3）置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中（4）保温1-2h后取出（5）电泳检测五、实验结果DNA链接产物图1 DNA片段的链接电泳图谱根据λDNA/EcoT14 I由11条DNA片段组成：由上到下一次为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421、74 单位（bp）:由图1的DNA链接电泳图可看出：DNA DNA片段链接电泳距离非常的短，说明分子量相较大，甚至超过19329bp,DNA的链接效果比较好。

DNA连接反应的步骤及说明

DNA连接反应的步骤及说明1.质粒DNA的制备：首先需要从大肠杆菌等细菌中提取质粒DNA。

通常方法是通过破碎细菌细胞并利用离心等步骤纯化质粒DNA。

也可以通过体外扩增技术如PCR获得所需的DNA片段。

2.DNA片段的制备：如果需要连接多个DNA片段，就需要对不同的DNA片段进行提取和纯化。

可以利用限制酶切、PCR等技术将所需的片段放入载体中。

3.线性化载体的制备：选取合适的载体，通常是质粒或噬菌体。

首先需要线性化载体，以便容纳连接的DNA片段。

这可以通过限制酶切除去所需连接部分的DNA序列来实现。

4.生成粘性末端：对于需要连接的DNA片段和线性化载体，需要使其末端具有互补碱基序列，以便后续的连接。

这可以通过在连接反应中引入适当的酶来完成，例如聚合酶、牛碱性磷酸酶等。

5.DNA连接反应的进行：将线性化载体与DNA片段放在连接反应的体系中，同时加入DNA连接酶和连接缓冲液。

酶的作用是催化连接反应，连接缓冲液提供了适合的pH和离子环境。

6.酶切修复：DNA连接反应后，需要将未连接的DNA片段去除，并对连接的DNA进行修复。

这可以通过加入限制酶来切除未连接的DNA，再加入DNA连接酶和连接缓冲液来进行修复。

7.质粒复制和筛选：完成酶切修复后，将连接后的DNA转化到宿主细胞中，使其进行质粒复制。

然后利用抗生素筛选或其他遗传标记来筛选出含有目标连接片段的质粒。

DNA连接反应是一个基本而重要的实验技术。

其步骤主要包括质粒DNA的制备、DNA片段的制备和线性化载体的制备、生成粘性末端、DNA 连接反应、酶切修复以及质粒复制和筛选。

在这个过程中，酶的作用起到了催化和修复的关键作用，而连接缓冲液则提供了适合的环境。

通过这一系列的步骤，可以将不同的DNA片段成功连接起来，实现对目标序列的操纵和重组。

这个技术在基因克隆、DNA工程和生物学研究中被广泛应用，为科学家提供了强大的实验工具。

【课件】DNA的结构课件生物人教版必修2

(A+G)/(T+C)=(A+C)/(T+G)= 1
双链中任意不配对的碱基之和相等且等于50％
A1 T1
C1 G1
T2
A2
G2 C2
互补的两条单链中任意不配对的两个碱基之和的比值互为倒数关系。
(A1+C1)/(T1+G1)=n → (A2+C2)/(T2+G2)= 1/n
(A1+ G1)/(T1+ C1)=m → (A2+ G2)/(T2+ C2)= 1/m
基互补配对方式不变
思考：在生物体内，一个最短DNA分子
也大约有4000个碱基对，请同学们计算
4 DNA分子有多少种？
种 4000
长链中的碱基对的排列顺序是千变万化的。
DNA分子的特性P59
1. 稳定性: DNA中脱氧核糖和磷酸交替排列的顺序不变
DNA中碱基配对的方式不变
2.多样性: 3.特异性:
H
3′
2′
5′
O
4′
1′ T
3′
3′
2′
2＇ 3＇
一个双链DNA分子(非
1＇
A
4＇
环状)游离两个磷酸基
5＇
团；
5′
③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，并且配对按碱基互补配对原则配对
A配T，C配G A与T之间形成2个氢键； C与G之间形成3个氢键。
之间通过氢键相连；
氢键
一条链的相邻碱基之间
通过
=
1/b
（4)（A1+ T1 ）/（ C1 +G1 ）= a
则（ A2 + T2 ）/（ C2+G2 ）=

基因工程2简答题

一、名词解释：载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。

多克隆位点（MCS）：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶酶切位点的ＤＮＡ片段。

COS位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。

PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

是利用两种寡核苷酸引物，分别与双链DNA片段的两端互补，形成DNA聚合酶反应中的模板和引物的关系，这是PCR技术的核心。

PCR聚合酶反应体系的一些重要条件包括：模板、一对寡核苷酸引物、4种底物dNTP和Tap DNA 聚合酶。

反应分为3步：双链模板DNA变性、退火和链的延伸。

1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解1 mg 标准DNA所需的酶量。

同S-D序列：含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列。

原噬菌体：整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。

粘性末端：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸片断，即5’突出。

这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。

因此称这些片断具有粘性，叫做粘性末端。

平头末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。

同位酶：指来源于不同微生物的酶，能识别相同的序列，切割方式不同或相同，这些酶称为~。

同裂酶：指能识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为~。

同尾酶：指来源和识别序列均各不相同，但切割后产生相同的粘性末端的酶，称为~。

启动子：指一段可以被RNA聚合酶识别，并使基因进行转录的DNA序列。

终止子：指给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

信号肽：质粒（plasmid）：指独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

重组与转化

5
3.不同粘性末端连接
无dNTPs存在时，行使 3’－5’外切
具有5’－3’DNA 聚合酶功能
酶功能
6
二、齐平末端（blunt end）的连接 1. 直接连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ P-OH 3’ 5’ P-OH 3’ -P 5’ -P 5’ 3’ HO3’ HO5’ P-OH 3’ -P 5’ 3’ HO7
2. 转化率
每1 gDNA质粒获得的转化子数。
一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以为：每微克载体DNA 转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）
35
3. 转化方法（1）热休克法（heat shock）简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（2）电转化法
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2. 脂质体（lipofectin）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。
脂质体有商业试剂盒（如lipofectin 2000）。
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3. 显微注射法(microinjection) 直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。
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外源基因导入细胞的方法
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第三节重组体导入宿主细胞
一、感受态大肠杆菌的制备
感受态：受体细胞最易接受外源DNA 片段并实现转化的生理状态。
1. 目的
增加受体菌细胞膜的通透性。
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2. 菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。
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3. 制备原理
用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。

dna中碱基的连接

dna中碱基的连接1.引言1.1 概述DNA是生物体中重要的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息，并决定了生物的性状和功能。

DNA的结构非常有序，其中最基本的单位是碱基对。

碱基对是由两个互补的碱基通过氢键连接而成的，在DNA的结构中发挥着重要的作用。

DNA分子由四种碱基组成，分别是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。

它们的连接方式是高度有序的，A总是与T连接，而G总是与C连接。

这种特定的连接方式保证了DNA分子的稳定性和准确性。

DNA中碱基的连接方式是通过氢键形成的。

氢键是一种特殊的化学键，它由氢原子与氮原子之间的相互作用所形成。

在DNA中，氢键连接了A 和T之间的两个碱基，以及G和C之间的两个碱基。

这种连接方式使得碱基对能够牢固地结合在一起，并且在遗传复制和蛋白质合成等过程中能够准确地进行信息传递。

DNA中碱基的连接方式对于维持DNA的结构和功能非常重要。

它们不仅决定了DNA分子的稳定性，还决定了DNA分子能够传递的遗传信息的准确性。

因此，对于了解DNA的结构和功能以及相关的遗传信息传递机制具有重要的意义。

在接下来的章节中，我们将详细介绍DNA的结构与功能，以及DNA 中碱基的连接方式，希望通过这篇文章的阐述，能够更深入地了解DNA的奥秘，并对未来的研究提供一定的参考和展望。

1.2 文章结构文章结构部分内容：文章结构：本文将分为三个主要部分进行讨论。

首先，引言部分将对本文的背景和目的进行概述。

其次，正文部分将具体介绍DNA的结构与功能，以及DNA中碱基的连接方式。

最后，结论部分将对整篇文章进行总结，并对未来研究方向进行展望。

引言部分将提供文章的背景和目的，以帮助读者了解为什么研究DNA 中碱基的连接方式是重要的。

这一部分将概述DNA是什么，其在遗传信息传递中的作用以及与生物学、医学等领域的关联。

同时，还将介绍本文的结构和内容安排，为读者提供阅读指南。

正文部分将分为两个小节。

第二章连接酶及其他(二)

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二、DNA连接酶的种类 T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶 T4噬菌体RNA连接酶
T4噬菌体DNA连接酶
该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。
该两个带有互补粘性末端的双链DNA分子
酶一条带有切口的双链DNA分子
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二、用途
➢ 进行同聚物接尾用末端转移酶给一群DNA分子3´-OH末端接
上oligo（dA）或（dG）,给另一群DNA分子3´OH末端接上oligo（dT）或（dC）,混合这两群分子,就能使末端转移酶接上的同聚物尾部退火形成环状分子。这种方法称为同聚物接尾法。
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第五节核酸酶
核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类：
1.基本知识
核酸酶S1是从米粉状曲菌（Aspergillus oryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量
32 000（32 ku），相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条件，产生带5´磷酸的寡核苷酸。
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2.特性
➢ 降解单链DNA或RNA,包括双链分子中的单链区域(如发夹结构),这种单链区域甚至可以小到1个碱基对的程度。
➢ 降解单链DNA的速度比RNA的速度快10倍。 ➢ 降解发应的方式为内切和外切。 ➢ 降解发应的最适pH为4.0～4.5。 ➢ 酶量过大时，伴有双链核酸的降解，该酶的双链降解活性仅为单链的1/75 000。
核酸酶S1的基本反应：内切单链DNA或RNA
核酸酶S1的基本反应：内切带切口或缺口的双链DNA
五、RNA酶H
该酶也为RNA限制酶，可水解RNA-DNA 杂交分子中的RNA链，产生5´-P核苷酸.

dna二级结构连接键

dna二级结构连接键
DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。

在DNA分子中，相邻核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键连接构成长链，前一个核苷酸的3′-羟基与后一个核苷酸的5′-磷酸结合。

二级结构的双螺旋的骨架由糖和磷酸基构成，两股链之间的碱基互补配对，是遗传信息传递者，也是DNA半保留复制的基础。

碱基之间以氢键相结合，其中，腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对，形成两个氢键，鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对，形成三个氢键。

DNA的二级结构连接键对于理解生命的基本机制和遗传信息的传递具有重要意义。

2DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解

引物3′端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G和C。
4. 碱基要随机分布。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。
5.引物GC含量在45-55% (40%~60%)之间，Tm 值最好接近72℃。
上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃。Tm值最好接近72℃。退火温度：一般低于Tm值2~10℃。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
引物长度要确保Tm值不低于54°C。
6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按经验，不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3’末端一般不达到 3 bp。引物间不应存在互补序列。尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体。
5´-GTTGACTTGATA
T
3´-GAACTCT
Primers That Form Dimers • Primer pairs should be checked for complementarity at the 3'-end. This often leads to primer-dimer formation with itself or with the other primer. • Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.