酶免技术 f教学内容

酶免技术原理及特点
原理：
➢酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应
➢酶对底物的显色反应
➢对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
特点：
➢灵敏度高、特异性强、 准确性好 ➢酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 ➢操作简便。
三、酶免疫技术分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位
免
疫
均相
技
术 酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
非均相 （异相）
液相酶免疫测定
（一）、均相酶免疫测定
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标
记酶的活性会发生改变，不用分离结合和 游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的 改变，而确定抗原或抗体的含量。
原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或 抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量 与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后， 底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
另：葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙酰胆碱酯酶等
酶和酶作用底物
❖ 底物选择：
1.底物应该是无色，经酶催化后有明显颜色变化； 2.所显色泽易于洗脱； 3.显色后的产物要稳定，定量检测时所产生的有
色物质应是可溶的； 4.价廉、易得、无毒。
酶和酶作用底物
常用底物
HRP的底物
HR DH2+H2O2P→ → → D+2H2O
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求： 纯度高、活性高
性质稳定 标记后不影响抗原或抗体的活性，也不降低酶的活性 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 酶的反应产物稳定，检测简便、快速 酶的底物易于配制保存，酶及底物安全、易得、价廉
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶）（无色） 亚铁血红素（辅基）（暗棕色） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
特异性
标记免疫技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性
灵敏性
标记免疫技术
❖ 标记免疫技术指用示踪物标记抗体或抗原进行的抗原 抗体反应；
❖ 并借助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电 子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果 直接镜检观察或进行自动化测定；
❖ 可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗 原抗体反应进行定性和定位研究；
能被58%-62%饱和 硫酸铵沉淀， pH3.5-12均较稳定
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 （2.5-3.0）
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶
碱性磷酸酶（AP）
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
CEDIA示意图
酶的活性与待测样品中抗原的量成反比。
（二）、非均相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
➢ 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试 验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定
第二节 ELISA的技术要点
基本原理
❖ 1.抗原或抗体的固相化 ； ❖ 2.抗原或抗体的酶标记 ； ❖ 3.受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计测量。
二、酶免技术原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性、 放大性
❖ 核心试剂: 酶标记的抗体或抗原
❖ 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
❖ 免疫技术： Ag +Ab → AgAb ❖ 酶标记的免疫技术： Ag*+Ab → Ag*Ab ❖ 标记物的作用有二：
一是便于观察反应结果， 二是提高测定的敏感性
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很 高
供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物
邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反应 后呈棕黄色，测定 波长492nm。不稳 定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
AP的 底物
酶和酶作用底物
常用底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
三个核心试剂
❖ 免疫吸附剂（固相载体） ❖ 酶结合物 ❖ 酶的底物
ELISA试剂盒组分
❖ （1）已包被抗原或抗体的固相载体； ❖ （2）酶标记的抗原或抗体（酶结合物）； ❖ （3）酶的底物； ❖ （4）阴性对照品和阳性对照品； ❖ （5）结合物及标本的稀释液； ❖ （6）洗涤液； ❖ （7）酶反应终止液。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶扩大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
克隆酶供体免疫测定 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意图
毒品(如吗啡及其衍生物) +溶菌酶 ；酶底物(藤黄微球菌)。酶的活性 与待测样品中抗原的量成正比，测定酶活性以标准曲线推算出待测抗原的量。
第十四章 酶免疫技术
第一节 酶免疫技术原理及分类 一、技术原理 二、分类
第二节 酶免疫技术要点 一、酶和酶作用底物 二、酶标记抗体或抗原 三、固方法类型及反应原理
第四节 酶免技术应用
小结
一、标记免疫技术
标记免疫技术 免疫技术+标记技术 =
抗原抗体反应 示踪物标记
❖ 也可对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量 测定。
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 化学发光技术 金免疫技术 生物素-亲和素免 疫放大技术 ……
三三大大经经典典标标记技记术免疫技术
发
放
光
射
免
免
疫
疫
技
技
酶 免 疫 技 术
术
术