应用PCR技术检测禽类源性成分

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荧光定量PCR法检测饲料中的牛、羊成分

列，别设计相的引物与探针。牛的探针和引物分即
１１２引物及探针设计（Ｅ公叫的ＰｉｒｘｒｓＴ．．ＰｒｍｅｐｅｓＭＥ
１．件）５软
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下游引物： ’ ＴＡＴＴＧＴ５ＴＧＧＡＧＣＡＴＴＧＧＧＣ３ ’ 牛的探针：ＦＡＭ一 ’ ＴＴＣ５ＴＴＣＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣ
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羊的探针：ＶＣ一 ’ Ｉ５ＡＧＧＧＡＴＣＣ ’ ＣＣＴＴＴＣ３一
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佩翻研究
ｆ）Ｐ．￣ｌ＂－一，ｑ，，ｌ｝Ｅｌｋｔｊ￣Ｎ０１，０２１２０
维普资讯
检测技术
１．酱通Ｐ．１２ＣＲ法（合酶链式反应）聚
一
般ＰＲ反应条件Ｃ
ｌＢｕｆｅ０Ｘｌｒｆ
疯牛病全称 “ 海绵状脑病 ” 是一发在牛牛。种身上的进行性中枢神经系统病变，｝前研究表明，＿Ｉ该病是由一种称为脑病毒的蛋白质所引发，其症状ｊ羊瘙痒症类似。人方面也柯类似症状的疾病，为在称 “ 雅氏症 ” 克。医学发现人 “ 雅氏症 ”叮能与携带病克毒的动物性食品有关，已经引起了国内外食品安全
快速、有效的检测方法防Ｉ疫 Ⅸ 牛、羊肉骨粉的使ｌ：
用。
不同物种都具有遗传卜独特性，的陔独特性体现在携带遗传信息的ＤＮＡ分ｌ。换言之，牛与千之：所以被认为足不同的、特的物种，独其最根本的原肉是牛与羊都具有自身特性的ＤＮＡ序列。所谓特异性序列是指某物种的某些ＤＮＡ序列为自然界其他物种所没有的。闪此根据卜述物种彳毖组水平Ｌ的Ｅ不同，我们ＮＣＢ上检索得到牛与羊的特异性序Ｉ

动物源性食品PCR检测方法的应用研究

1　实验材料与实验方法1.1　实验材料本次检测实验所用的实验材料为牛肉卷，该材料从农贸市场所购买。

1.2　实验仪器和实验试剂本实验所采用的实验试剂主要包括DNA快速提取试剂盒、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物以及DNA回收试剂盒等。

并利用实验试剂配置LB液体培养基和LB固体培养基等。

本实验所采用的实验仪器包括超纯水制备装置、制冰机、分析天平、真空干燥箱、高压灭菌器、分光光度计和离心机等。

1.3　实验方法1.3.1　样品基因组DNA的提取与检测（1）将采集的牛肉卷样品进行剪碎处理，并进一步研磨至粉末状，在研磨后得到的粉末中加入一定量的Buffer GA和RNase A并进行震荡，以确保样品中的RNA得到有效去除。

（2）在反应物中加入适量的Proteinase K和Buffer GB进行震荡混匀，并在65 ℃下放置一段时间，随后对反应物进行高速离心，并吸取上清液，在上清液中加入无水乙醇再进行上下颠倒，充分混匀。

加入无水乙醇后产生的白色沉淀可忽略。

（3）将得到的混合溶液和沉淀全部转移到吸附柱中，并再次高速离心，高速离心结束后加入一定量的Buffer GW1再进行重复的高速低温离心，以平衡吸附柱，从而获得质量更好的DNA产物。

（4）将吸附柱放置于真空干燥箱中晾干后，取出，放置于已灭菌的离心管中，并加入适量的Buffer GE或灭菌水，放置数分钟后再进行高速离心，以获得DNA溶液。

对于所获得的基因组DNA质量通常采用OD260/280值进行描述，当其在1.7～1.9区间时，则证明基因组DNA质量相对较好。

1.3.2　引物设计合成与检测在引物的设计合成步骤中，应当根据NCBI Genebank所提供的牛的细胞色素基因序列，使用primer5.0软件设计相应的引物。

通常使用目标动物的线粒体基因中的细胞色素b基因进行测定，这种基因变异率较低，用于动物源性食品的物种分类鉴定更为适合[1]。

在引物设计完成后，对样品DNA进行PCR扩增。

实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分

１３仪器．
进口ｌ１ｌ为农业大国。国必须加强对动物源性饲料。作我建立能够快速、确鉴别检测饲料中鸡源性成分的方准
法。本研究采用常规ＰＲ方法和实时荧光ＰＲ方法ＣＣ
检测饲料巾鸡源性成分法的灵敏度高．用性强。方实
宁省
采Ｐ。公。ＭｎＡｕｃｎ用ｇ司ａｔＮＰｆｉ … “ ｇｉ ……ａ。６ ’ ｅＤｉｔ …“ ｍａ的 …… … ｃ …“ ｉ。
实时荧光ＰＲ扩增反应具体条件：５℃ ３、Ｃ９０Ｓ
穆春、孙屏、刘岑杰、徐建平，单位及通讯地址同第一作者。杨滴、夏元凤，大连标准检测技术研究中心。收稿日２１— ２Ｏ期：０００一ｌ
引物合成及探针合成、标记购自ＴＫＲａａａ大连宝
生物公司，实时荧光ＰＲ引物序列及探针的序列见Ｃ表１常规ＰＲ引物序列及扩增长度见表２；Ｃ。１模板ＤＡ的提取．５Ｎ
适用于鸡源性成分的检测
《饲髑工业》２１第３卷第７期・００年１
实时荧光ＰＲ和常规ＰＲ方法ＣＣ检测饲料中鸡源性成分
刘彦泓穆春孙屏杨滴刘岑杰夏元凤徐建平
摘要
根据鸡线粒体ＤＡ序列，计并筛选了鸡源性特异引物及探针，立了饲料中鸡源性Ｎ设建
应试剂盒（ｒｍｘｘａＴ、０ＰＲ缓冲液／ＴＰｅｉＥｑ）１ｘＣＴＭｄＰ溶液、ＮＥＴｑＮｘａＤＡ聚合酶、０ｋｒ１０ｂＭａｅ（ｐ片段大小分别为１００、

应用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR溶解曲线检测鹌鹑源性成分

文章编号：２８７３（００１－００００５ — ０３２１）７０７－３
２００４年以来，随着数个国家高致病性禽流感的
术鉴别检测鹌鹑源性成分的方法。
１材料与方法
１１材料．
相继发生，除鸡以外已波及到人、天鹅、猫等的死
业部也将其列为一类传染病『２ｌ。
目前，主要的动物源性成分鉴别检测的方法有
１１１样品的采集及处理．．
本实验所用鹌鹑、鸵
鸟、、鹅鹧鸪的肌肉样品和鹌鹑肉骨粉样品由中华人民共和国深圳检验检疫局提供；、、、、、鸽鸡鸭马牛
亡，因感染禽流感而致死的人数不断增加，禽类肉食品及饲料的安全性已关系到人类的安危。禽流感
（Ｉ被国际兽疫局（Ｉ定为Ａ类传染病，被列Ａ）ＯＥ）并入国际生物武器公约动物类传染病名单＿。我国农１１
摘要：据ＧｅＢｎ根ｎａｋ中的鹌鹑线粒体ＤＮＡ（ＤＮＡ）２ｍｔ１ＳＲＮＡ基因保守序列，Ｐｉｒ．用ｒ５０软件设计了１对针ｍｅ
对鹌鹑的特异性扩增引物，立了一种检测鹌鹑动物源性成分的ＳＢＧｒｎＩ实时荧光Ｐ建ＹＲｅｅＣＲ方法。过ＳＢ通ＹＲ
麓溪豢翥・ｅ囊ｅ镪ｌ０一ｓ
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PCR技术在食品动物源性检测中的应用

ＮＣ某些肉类的同源性特点，肉制品进行搀假，对损害广大近年来，以ＤＡ为基础的ＰＲ技术广泛地被用来鉴消费者的利益。尤其上个世纪疯牛病（ａＯｉ定食品中的动物源性，ｍｄＣＷｄｓ — 由于ＰＲ方法比较简便，异Ｃ特性和灵敏度都很高，国内外已经运用该技术和其他技ｅｅ羊瘙痒病的发现和流行，ａ）ｓ、使得美味成为“ 死亡菜谱 ”食品、品、，药饲料中的牛源成分和羊源成分受到严格限制。这就要求对食品的动物源性进行严格的品质
摘
要：简述了ＰＲ技术检测食品动物源性的基本原理和方法，并对近年来国内外专门用来检测食品动物源性的Ｃ
ＰＲ术作了简介，Ｃ技主要包括常规ＰＲ多重ＰＲ实时荧光定量ＰＲ定量竞争ＰＲ和ＲＰ — ＣＣ、Ｃ、Ｃ、ＣＡＤＰＲ等。
关键词．Ｃ动物源性；测ＰＲ；检
术结合建立了多种鉴别动物源性成分的方法㈣。１ＰＲ技术鉴定食品动物源性的方法原理Ｃ
聚合酶链式反应（ｏｍｒｓｈｉａｔｎＰＲ）ｐｌｅａｅａｒｃｉ，Ｃｙｃｎｅｏ
检验和鉴定，也对我们的检测技术提出了更高的要求。
对食品、药品以及饲料产品成分进行动物源性鉴
ＡＰＩＡＩＮＯＣＥＨＩＵＯＤＴＣＩＮＯＨＮＭＬＯＩＩＦＦＯＰＬＣＴＯＦＲＴＣＮＱＥＴＥＥＴＯＦＴＥＡＩＡＲＧＮＯＯＤＰ
ＧｎｄｎＣｕｓｅｇ，ＡＮｎ－ｕＡＯＤａ－ａ，ＡＯＹ－ｈｎ＂ＷＧＹｉｇｈａ

实时荧光PCR检测食品肉类种源的方法探讨

分析与检测1　PCR检测技术概述1.1　PCR技术简介PCR技术始于1985年，其用于特定的DNA片段的快速检测，与传统的检测方法相比，能够对特定的成分进行快速检测，并能够快速检测出目标物质中的不同成分，因此，该技术在目前的食品成分检测和致病菌检测等多方面均得到了越来越广泛的应用[1]。

1.2　PCR技术的优势传统的成分检测环节往往需要大量的人力物力，且操作的复杂程度高，由于各种成分的生物特性和化学性质都有着一定的区别，对各个成分进行分别鉴定时，经常需要多次调整环境的pH、温度等参数，任何一个环节的失误都可能导致前功尽弃，而PCR技术的应用，有效解决了上述问题[2]。

具体来看，PCR技术主要表现出以下两方面的优点：①便利性好，与传统方法相比，PCR技术只需使用较少的设备和常规的操作步骤即可实现检测，整个过程更加便捷；②速度快，可以短期进行大量的检测[3-4]。

2　食品中肉类种源的实时荧光PCR检测2.1　实验材料2.1.1　实验试剂实验试剂包括琼脂糖、GelRed染色剂、50 bp DNA Ladder、无水乙醇、DNA提取试剂盒、DreamTaq PCR Master Mix，以及市售的牛肉卷样品和牛肉。

2.1.2　实验仪器实验仪器包括高速冷冻离心机、恒温水浴槽、涡旋振荡器、电子天平、生物分光光度计、制冰机和实时荧光PCR仪。

2.2　实验方法2.2.1　样品处理及基因组模板制备首先，采用剪刀和研钵，将所购买的样品剪碎和研磨，以进行匀质处理，其中，牛肉样品需要先在105 ℃下烘干，而后再进行均质处理。

两种样品的均质处理，应当保持一定距离，分开进行，避免交叉污染。

在均质处理步骤完成后，按照DNA试剂盒上的说明进行后续操作，以获取OD260/OD280比值处于1.7～2.0区间内的动物组织DNA。

2.2.2　引物与探针的合成及有效性验证根据Genbank所公布的基因序列，并通过Meglign软件进行对比分析，选取匹配度低和差异大的序列片段，并使用primer express2.0软件，在引物探针设计原则指导下，设计牛源成分的特异性引物和探针。

肉制品中鸭源性成分的荧光定量PCR检测研究

肉类掺假是我国食品行业的突出问题之一。近期据媒体报道，一些不法企业使用廉价的鸭肉代替价格较高的牛肉、羊肉等肉类生产食品进行销售，严重损害了消费者的利益。相比于猪肉，鸭肉的纹理与牛羊肉更为相似，因此使得相应的掺假具有更大的隐蔽性。对食品监管部门而言，建立快速有效的食品中鸭源性成分检验方法，从而对此类不法行为进行监管已十分必要。以 PCR 技术为基础的种属检测技术已是食品中肉类成分鉴别的主流技术。自从 Tartaglia 等首先
摘
要：动物源性检测技术是对肉制品掺假进行监管的有效手段，但国内尚未有基于荧光定量PCR技术的
食品中鸭源性成分检测方法的报道。本研究根据鸭线粒体基因组细胞色素b基因中的保守序列设计了鸭特异性引物和Taqman探针，建立了肉制品中鸭源性成分定性和定量检测的荧光定量PCR技术。经验证，引物与探针对于鸭源性成分的特异性良好，检测灵敏度达到1.78 pg/反应。对模板的绝对定量分析证明了该方法可对鸭肌肉组织DNA进行准确定量。使用该技术对市售肉制品的检测发现了大量使用鸭肉假冒的牛羊肉制品。总之，本研究建立了鸭源性成分检测的荧光定量PCR方法，为肉制品质量控制提供了有效的技术手段。关键词：鸭源性成分；荧光定量 PCR；肉类掺假；检测方法中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：
2012-12-05
肉制品中鸭源性成分的荧光定量PCR检测研究
张驰 1, 2*，邱皓璞 2，张筠 3
(1. 东南大学生物电子学国家重点实验室，江苏南京 3. 先声再康江苏药业有限公司，江苏南京 210018； 210028； 2. 国家农副产品质量监督检验中心，南京市产品质量监督检验院，江苏南京 210042 )
报道了用 PCR 方法检测饲料中的牛、羊源性成分至今[1]，大量研究报道了应用 PCR 及多重 PCR 技术对食品中不同肉类种属的鉴别方法[2-6]。近年来，荧光定量 PCR 技术的迅速发展又将种属鉴定技术发展到了新的高度。相比于普通 PCR，荧光定量 PCR 具备特异性好、检测自动化程度高等优势，并使得 DNA 模板的定量检测成为可能[7-10]。然而，在鸭源性检测方面，目前国内仅有张娟等针对鸭线粒体基因组中的特异性序列，使用 PCR 扩增、电泳检测的流程对食品中的鸭源性成分进行检测道。本研究设计了用于肉制品中鸭源性成分鉴定的 Taqman 荧光定量 PCR 引物与探针，验证了方法的特异性与灵敏度，建立了鸭源性成分的定性、定量检测方法，并对大量市售食品样本进行了鸭源性成分的检测。 1 1.1 材料与方法材料与试剂 TIANNamp Geromic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）北京天根公司；Taqman Real Time PCR 预混液日本 TaKaRa 公司；电泳级琼脂糖南京生兴公司；引物与荧光探针均委托南京金斯瑞生物公司合成。 1.2 仪器与设备 7500 Fast Real-Time PCR 仪美国 ABI 公司；Viti 96 Well PCR 仪美国 ABI 公司；凝胶成像系统加拿大 Bio-rad 公司；紫外分光光度计美国 Lambda 公司。 1.3 样本总 DNA 的提取使用离心柱式血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒提取 50 mg 肉制品中的总 DNA。操作过程遵照试剂盒说明书进行。将样品剪碎后于含蛋白酶 K 的细胞裂解液中消化，使用吸附柱对总 DNA 进行吸附、洗涤和洗脱，得到纯化的样品总 DNA 溶液。测定其 OD260 数值，计算 DNA 浓度。 1.4 荧光定量 PCR 引物与 Taqman 探针设计购置市售肉鸭 2 种、麻鸭 1 种、野鸭 1 种，根据 Genbank 已发表的鸭（Anas platyrhynchos）线粒体基因组序列（HM010684.1）设计用于扩增鸭细胞色素 b 基因 813 bp 部分序列（61-873）的通用引物，正向引物序列为 ATCAACAACTCCCTAATCGA （ 5’-3’ ），反向引物序列为 GATTGACCGCAGGATGGCGTAG（5’-3’）。分别提取不同品种鸭肉的总 DNA 作为模板，于 ABI Viti 96 Well PCR 仪上对目标序列进行扩增。反应体系为 20 μL，包含 Takara PCR Master Mix（2×）10 μL、通用引物（10 μM）各 1μL、模板（10 μg/μL）1μL。反应条件为：95 ºC 预变性 3 min；30 个循环的 95 ºC 30 s、50 ºC 30 s、72 ºC 1 min；72 ºC 7 min。反应产物全部进行 1%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对 813 bp 处的条带进行回收纯化并委托测序。分别将各品种鸭肉的测序结果进行比对，选择各个品种间完全一致的约 700 bp 序列，使用 ABI Primer Express 软件设计 Taqman 荧光定量 PCR 引物和探针。将设计的各组引物所扩增的目标序列分别与牛、猪、绵羊、山羊等常见畜肉以及鸡、鹅、鸽等常见禽肉已发表的细胞色素 b 同源序列进行比较，选取目标序列的关键位点（引物近 3’端结合位点、探针近 5’端结合位点）在鸭和各对照物种间均存在 3 个以上不同碱基的一组引物与探针作为鸭源性检测的特异性引物和探针（图 1）。正向引物 D1 序列为 GGCCTCCTACTGGCTATGCA （ 5’-3’ ），反向引物（ 5’-3’ ），探针序列 D2 序列为 DP 为 GAGTCAGCCATATTGGACGTTT

《利用PCR和电泳技术检测食品中的动物源性成分》说课稿(全国实验说课大赛获奖案例)

《利用PCR和电泳技术检测食品中的动物源性成分》说课稿一、使用教材：本实验选自人教版高三生物选修一生物技术实践模块专题5：DNA与蛋白质技术课题2：多聚酶链式反应扩增DNA片段以及课题3：血红蛋白的提取和分离二、实验器材：仪器：离心机、水浴锅、PCR仪、电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、微量可调移液器、冰箱耗材：1.5ml小指管、PCR管、枪头试剂：组织DNA提取试剂盒、无水乙醇、引物、PCR Mix（包含DNA复制的原料、Taq酶、缓冲液等）、DNA Marker、SYBR核酸染料、琼脂糖、TAE电泳缓冲液三、实验创新要点/实验改进（一）材料改进1. 选取肉类做实验材料，可选择的种类丰富、容易获取且易于提取DNA (即使是高温加工过的熟肉都能提取得到完整的DNA)。

2. 本实验所选取的5对引物特异性较好，扩增效果稳定。

（二）方案改进1. 将PCR实验与DNA电泳实验整合到一起，让PCR结果的检测更加准确和直观。

2. 本实验以问题串的形式提出各种可能的实验结果，引导学生分析如何设置对照来解决实验过程中遇到的这些问题，从而明白设置阴性、阳性和空白对照的必要性，排除假阳性和假阴性的干扰，让实验结果更加准确有说服力。

3. 实验最初设想来自于学生，学生亲历“发现问题→提出假说→设计实验→实施实验→得出结论”的整个过程，体会并学会用生物学原理解决实际生活问题。

四、实验原理利用引物与模板特异性结合的原理，通过设计特异性引物可以对特定的DNA片段进行扩增。

生物大分子带负电，在电场中会迁移，在琼脂糖凝胶中迁移的速度与分子量的大小成正相关，所以可以将不同大小的DNA片段进行区分，再与标准DNA进行比对，大致估测出待测DNA的片段长度。

五、实验教学目标1. 学生结合生物体中DNA复制过程以及生物大分子的特性说出PCR技术和电泳技术的基本原理，进一步加深结构与功能密切联系的生命观念。

2. 学生从引物与模板的特异性结合角度分析，得出利用PCR和电泳技术对生活中未知来源肉类进行分子鉴定的机理，培养科学思维。

PCR技术在食品科学领域中的应用

食品生物技术导论——PCR技术在食品科学领域中的应用学院：食品学院班级：食工09级一班学生：蒋璐璐学号：2009113167指导老师：刘福林PCR技术在食品科学领域中的应用摘要：本文综述了PCR 的技术原理，PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。

PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常。

PCR技术的发展历程及其在食品微生物检测、转基因食品、食品成分检测等方面的应用并对PCR技术今后的发展作出展望。

关键词：PCR技术原理食品应用引言：PCR(Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶链式反应，又称多聚酶链反应、基因的体外扩增法、无细胞克隆技术等。

这是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法。

利用此方法,能使极其微量的目的基因或某一特定的DNA片段在几小时后迅速扩增数百万倍,且无需通过繁琐费时的基因克隆程序,便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。

1983年，PCR技术由美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B. Mullis发明，因其特异性强,灵敏度高、快速和准确等优点，在食品、农业、医药、分子生物学等领域得以广泛的应用。

本文主要对PCR技术在食品科学领域中的应用进行综述。

1 、PCR技术的基本原理PCR技术由三个步骤反复的热循环构成:高温变性、低温退火和适温延伸。

高温变性，在高温(95℃)条件下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；低温退火，在低温(37～55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链；适温延伸，即在特异耐热酶-TaqDNA聚合酶的最适温度(72℃)时,引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成新的DNA链[1]。

新合成的DNA双链又可作为扩增模板，反复进行解链、退火、延伸三个步骤的热循环，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍, PCR产物得以2n 的指数形式迅速扩增,经过25～30个循环后,理论上可使基因扩增109 倍以上,实际上可达106～107 倍。

多重PCR 法检测5 种动物源性成分的适用性验证

食品科技多重PCR法检测5种动物源性成分的适用性验证马慧娟，高　宏*，牛鹏飞，梅　婵(江苏省理化测试中心，江苏南京 210042)摘　要：为了探索新建立的一种多重PCR对动物源性食品检测的适用性，实验采用猪、牛、羊、鸡和鸭肉混合的方法，用多重PCR对混合肉样进行检测，以验证多重PCR的检测的可行性和有效性。

通过对市售20种样品提取DNA进行多重PCR 和单一PCR的5种动物源性成分检测结果比对，进一步比较两种方法检测结果的不同。

结果表明，建立的多重PCR可同时检测出2种、3种、4种和5种动物源性成分，采用多重PCR法和单一PCR法对20种市售样品分别检测，两种方法结果无差异，表明所建立的多重PCR法可检测猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物源性成分。

关键词：动物源性食品；多重PCR；单一PCR；适用性应用PCR方法检测食品中动物源性成分的研究和标准有很多，目前已颁布的国家标准、行业标准和地方标准主要是基于常规定性PCR法和实时荧光PCR法对单一动物源性成分的定性检测。

在实际工作中，对于动物源性成分不明确的加工制品，在需明确其成分时，需要通过不同的方法进行多次检测才能确定结果，其周期长、工作量大、成本高。

在未来的动物源成分检测中，基于常规定性PCR法的检测技术已经越来越不能满足多种动物源性制品的鉴定需求，因此建立多重PCR法提高检测的效率与通量对肉类食品安全的及时监管十分重要[1]。

本研究通过对新建立的一种检测动物源性食品中猪、牛、羊、鸡和鸭成分的多重PCR法进行混合肉样检测，验证其方法的适用性和可行性，并用建立的多重PCR检测方法和单一PCR检测方法对市售的20种动物源性食品分别进行检测，验证多重PCR法鉴别猪、牛、羊、鸡和鸭成分可行性。

1　材料与方法1.1　材料及试剂鲜肉（猪、牛、羊、鸭、鸡）购自南京某大型菜市场，-20 ℃保存。

加工肉制品（鸭血、牛肉卷、鸡肉火腿肠、午餐肉罐头等）购自南京某菜市场、超市或火锅食材店。

荧光定量PCR技术用于食品肉类种源掺假鉴定

分析与检测Tlogy科技26 食品安全导刊 2017年4月在国内及国际贸易中，我国肉制品掺杂、以次充好的欺骗行为屡见不鲜，严重损害了消费者的利益，并且对我国出口肉制品在国际市场上的声誉造成损害。

要杜绝这些掺杂使假的现象，关键手段是要建立一种能快速准确鉴别动物种源成分的检测方法，为上述产品的质量做本质上的把关，提高执法的科学性和高效性，进一步提高检验检疫通关速度。

因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测肉类种源的检测方法一直是有待解决的难题。

目前，动物源性成分鉴别的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法。

物理学鉴别方法常用镜检法，通过观察来区分禽类、哺乳动物和鱼类，但该方法本身却并不能区分动物的种类。

在检测的过程中，需要有经验的检验员进行操作，可以定量检测0.1%以下的骨片段。

化学方法进行动物源性分析主要有结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

本方法检测原理主要利用一对动物线粒体基因保守区域特异性引物，配以FQ-Buffer、耐热DNA 聚合酶(Taq 酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分，通过聚合酶链反应(PCR)-荧光法进行体外扩增，从而达到快速检测的目的。

基于荧光定量分析技术，根据常见动物如猪、驴、牛、羊的DNA 序列，设计并最后确定了特异引物，建立了荧光定量PCR 检测方法，可以用于猪、驴、牛、羊肉及肉制品的种源成分快速鉴定检测分析，具有高效、快速、准确的特点，可进行批量样本快速检测。

方法主要用于检测动物组织、血液以及食品、肉类制品、饲料中有动物种源性特定成份鉴定，是适用于政府检测机构、食品加工企业、进出口贸易企业的优秀的检测分析方法。

并且检测结果能够达到与国家要求的行业检测标准相一致，与欧盟、美国FDA 检测标准相符合。

荧光定量PCR 技术用于食品肉类种源掺假鉴定□ 北京维德维康生物技术有限公司供稿荧光定量PCR 技术检测动物性食品中驴源性成分具有较高的准确性与稳定性，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。

实时荧光PCR法检测动物源性成分的定性方法验证

QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING
质量安全与检验检测Vol.31 No.2 2021年第2期
米、大豆、花生均为超市购买。
2.2主要试剂
动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒
（DP323-02）（天根生化）。
鸡种特异性基因测定试剂盒（荧光PCR法）（上海之江）。
2021 年第 2 期 Vol.31 No.2
质量安全与检验检测 QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING
实时荧光PCR法检测动物源性成分的定性方法验证
徐美鑫张澜相茂花
(日照市场监管检验检测中心山东日照276800)
摘要本文以鸡源性成分为例，研究了 GB/T 38164-2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》的定性方法验证，以证明该方法的可行性及适用性，以期为基因扩增检测领域的方法验证工作提供参考。验证参数为DNA提取效果评价、重复性、检出限和基质效应。结果显示,DNA提取效果良好，不存在抑制剂；该方法重复性较好；基质效应无影响；检出限为0.1%。各参数均满足标准的要求，该方法具有较好的可行性及适用性。
与验证指南》要求，并参考RB/T 004-2019《转基因
检测方法验证指南＞[2],以鸡源性成分为例研究GB
38164-2019《常见畜禽动物源性成分》方法验证，验
证了该方法的DNA提取效果评价、重复性、检出限
和基质效应。
3.2 DNA提取质量
使用DNA提取试剂盒对现杀整鸡进行DNA提
取,PCR体系配制及反应参数按照鸡种特异性基因测定试剂盒进行操作。
注:பைடு நூலகம்D—未检出
4.3检出限通过量化样品中核酸的最小检测量来评估检出

聚合酶链式反应法检测饲料中鸡源性成分

搏铷饲科工
ＣＥＲＥＡＬ＆ＦＥＥＤＩＵＳＴＹＮＤＲ
２０１Ｎｏ．０，４
趋分一潮析
聚合酶链式反应法检测饲料中鸡源性成分
刘彦泓郝苗闵建杨滴刘岑杰夏元凤，，，，，
（．１大连市产品质量监督检验所，宁大连辽１６２；２大连标准检测技术研究中心，宁大连１０１．辽１６２）１０１
２０７０型。１４引物．
以ＮＣＩｎＢｎＢｅ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｋ序列为基础设计鸡源性特Ｇｅ异性引物。所有引物由ＴＫａａ连宝生物公司合ａＲ大成，物序列及扩增片段的长度见表１引。
表１引物序列及扩增长度
ＤｅｅｔｏｆｃｃｅｅｉｅａｅｉｌｎｆｅｓｂｔｃｉｎｏｈｉｋｎｄｒｖｄｍｔｒａｓｉｅｄｙＰＣＲ
ＡＳＲＴ：ＢｈｏｉｇｃｉｅｈｎｒｓｍｅＤＢＴＡＣｙｃｏｓｈｃｎｃｏｄｉｏＮＡＳｔｅｓｕｙｏｊｃ，Ｐｔｏｏｅｅｔｇｔｅｃｉｋｎｎｋｏ３ｈｔｄｂｅｔＣＲｍｅｈｄｆｒｄｔｃｉｈｈｃｅｎ
引物名称引物序列扩增产物长度
用性强。１材料与方法
１１材料．
低温高速离心机，国Ｅｐｎｏｆ司５１Ｒ德ｐｅｄｒ公４７型；生物安全柜，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司ＢＨＣ一１０３０ⅡＡ２型；Ｃ仪，国ＡＢＰＲ美Ｉ公司

种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分

164㊀2021Vol.47No.3(Total 423)DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.024477引用格式:张媛媛,孟镇,仇凯,等.种属特异性PCR 法鉴别罐头食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭源性成分[J].食品与发酵工业,2021,47(3):164-169.ZHANG Yuanyuan,MENG Zhen,QIU Kai,et al.Species-specific PCR method to identify animal-derived in-gredients of pork,beef,mutton,chicken and duck in canned food [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(3):164-169.种属特异性PCR 法鉴别罐头食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭源性成分张媛媛1,2,孟镇1,2∗,仇凯1,2∗,东思源1,2,武竹英1,2,郭新光1,2,钟其顶1,21(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)2(全国食品发酵标准化中心,北京,100015)摘㊀要㊀建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源成分种属特异性PCR 鉴别方法㊂通过使用猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA 模板进行PCR 扩增,得到分别为212㊁147㊁202㊁131㊁201bp 的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotech-nology Information ,NCBI )进行BLAST 比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测㊂该方法5种动物引物种属特异性良好,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%㊂在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符㊂该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值㊂关键词㊀肉类罐头;肉类掺假;线粒体;动物源性成分;食品真实性;种属特异性PCR第一作者:硕士研究生(孟镇高级工程师和仇凯高级工程师为共同通讯作者,E-mail:syaufood@;ufoqk@)㊀㊀基金项目:国家重点研发计划(2019YFC1605202,2018YFC1603203)收稿日期:2020-05-18,改回日期:2020-08-06㊀㊀随着食品供应链的全球化和复杂化,市场竞争日益激烈,食品欺诈问题日渐突出,其中肉制品掺假现象层出不穷㊂一些不法商贩在利益驱使下,为了获得不法利润,利用掺假等恶劣手段,将低价格肉类掺杂到高价肉中,以假乱真㊁以次充好扰乱市场秩序,侵犯消费者权益,甚至涉及到宗教信仰问题㊂这些现象在国内外常有发生[1-6]㊂肉类罐头食品因其品种繁多㊁口味较好㊁便携㊁储存时间长等特点而深受广大消费者的喜爱,但由于经过了斩拌㊁调味㊁高温加工等处理[7-9],普通消费者难以通过感官分辨掺假肉,执法部门在取证过程中同样缺乏简便有效的鉴别手段㊂目前我国对于生鲜肉类食品及一般热加工肉类食品的检测方法及标准趋于完善,但对于罐头食品这种深度热加工食品的动物源成分鉴别研究很少,因此建立一种快速㊁准确鉴定肉类罐头食品中动物源性成分的方法非常有必要[10-11]㊂目前,常见的肉制品掺假鉴别方法主要有蛋白质鉴别酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)㊁等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)㊁高效液相色谱(HPLC)和核酸检测法[12-17]㊂不同物种间核酸极强的特异性,使得核酸检测方法具有特异性强㊁灵敏度高㊁结果准确的特点㊂种属特异性PCR 技术则是应用核酸在不同物种间具有极强的特异性这一特点,根据扩增的目的基因设计高特异性引物,扩增出物种特有的目的片段,此技术被广泛地应用于生鲜肉及加工肉制品[18-21]的动物源性成分掺假的鉴别㊂本研究在国内首次以肉类罐头食品为研究对象,建立了适用于长时间高温加工食品中主要的5种动物源成分鉴别方法㊂针对肉类罐头食品经过长时间高温加工导致DNA 片段化严重的实际情况,从线粒体DNA 入手,根据不同物种之间线粒体DNA 的差异,从数据库中筛选出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种常用肉类的特异性扩增引物,建立一种快速㊁准确的鉴别肉类罐头及其他经过长时间高温处理的食品中动物源成分的方法,并对我国市售肉类罐头产品进行了检测,初步调查了我国肉类罐头产品的动物源真实性情况,为其在动物源性食品真实性鉴别的标准化中的应用奠定了坚实的基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀实验材料新鲜猪肉㊁牛肉㊁羊肉㊁鸡肉㊁鸭肉,北京市超市和农贸市场;20个不同种类㊁不同加工工艺和不同源性成分的罐头样品,市售样品㊂1.2㊀试剂dNTP㊁10ˑPCR缓冲液㊁Taq DNA聚合酶㊁100 bp ladder DNA marker等,北京全式金生物技术有限公司;异硫氰酸胍法裂解液[5mol/L GuSCN㊁0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)㊁体积分数1.3%Triton-X 100,0.02mol/L EDTA(pH8.0)]㊁V(氯仿)ʒV(异戊醇)=24ʒ1㊁TE缓冲液(0.01mol/L Tris㊁0.001mol/L EDTA,pH8.0)㊁异丙醇㊁无水乙醇,上海生物工程有限公司㊂1.3㊀主要仪器冷冻离心机,美国Sigma公司;Tgradient PCR扩增仪,德国Biometra公司;DYY-8C型高压电泳仪,北京六一仪器厂;CV-1000型凝胶成像系统,法国VIBER LOURMAT公司;pHSJ-4A型实验pH计,上海科学仪器有限公司;TMS1500恒温混匀仪,北京莱普特科学仪器有限公司㊂1.4㊀实验方法1.4.1㊀引物根据文献筛选猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭线粒体DNA种属特异性引物,交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,各引物终浓度均为10mol/L,引物序列见表1㊂表1㊀种属特异性引物Table1㊀Species-specific primers物种引物序列(5ᶄ-3ᶄ)片段大小/bp退火温度/ħ参考文献猪F:GCCTAAATCTCCCCTCAATGCTA21256[22]R:ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG牛F:CACAATCCAGAACTGACAC14756[23]R:GATGGCTTGGGAATAGTACGA羊F:CCTCCAACAGTGAATACTT20256[23]R:TCCTCCTCATAAAGGAATGGCC鸡F:CTATAATCGATAATCCACGATTCA13163[24]R:CTTGACCTGTCTTATTAGCGAGG鸭F:CATCTATCCTGCTAGCCGCC20158[25]R:TTGAGTGGAAGAATGCC1.4.2㊀高温加工肉类模拟样品的制备为确保检测方法对深加工食品检测的可行性,将鲜猪肉㊁鲜牛肉㊁鲜羊肉㊁鲜鸡肉㊁鲜鸭肉分别在灭菌锅中121ħ高温处理30min,模拟肉类高温加工过程㊂1.4.3㊀DNA模板的提取根据前期实验室对于肉类罐头食品中总DNA提取方法的研究,DNA模板选用异硫氰酸胍法进行提取[26]㊂1.4.4㊀PCR扩增PCR反应采用25μL体系:10ˑPCR buffer2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,20pmol/μL引物各1μL,模板DNA1μL,Taq DNA聚合酶0.3μL (1.5U),MgSO4(50mmol/L)1μL,双蒸水补足体积㊂扩增条件为:94ħ3min,94ħ30s,57ħ30s, 72ħ30s,35个循环,72ħ5min㊂扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.4.5㊀引物特异性试验分别以高温加工的猪肉㊁牛肉㊁羊肉㊁鸡肉㊁鸭肉5种高温加工肉类样品总DNA为扩增模板,使用种属特异性引物对上述各种DNA进行PCR扩增反应,同时设立以H2O为模板的空白对照,评价方法的特异性㊂1.4.6㊀灵敏性试验为了验证该方法的灵敏性,分别将高温加工的各种动物样品用高温加工的鸡肉进行混合稀释,分别制备出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭肉成分占5%㊁2.5%㊁1%(质量分数)的样品㊂将上述样品充分混匀,提取DNA,进行动物源性成分灵敏性检测㊂1.4.7㊀市售罐头样品检测将20个市售肉类罐头样品进行PCR扩增,扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,并将检测合格的PCR纯化产物送往上海生工生物科技有限公司进行测序,然后通过Chromas软件对其峰值图进行查看㊂1.4.8㊀数据处理运用美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)的BLAST 程序,把样品的PCR产物测序结果与GenBank数据库中所收录的基因片段进行比对,从而保证PCR扩增的正确性㊂2㊀结果与分析2.1㊀特异性试验结果分别使用5种动物源性成分特异性引物对,以制备的猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种高温加工肉类样品总DNA 为模板,进行PCR扩增反应,琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示㊂5种动物源性成分猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭出现相符的目标条带,而其他动物基因组DNA及空白对照均无条带出现,也无非特异性条带,说明此方法具有较好的特异性㊂2.2㊀引物灵敏性试验结果分别以猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭肉占比为5%㊁2.5%㊁1%的样品提取的总DNA为扩增模板,使用种属特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示㊂不同成分含量为1%的样品对应泳道仍有明显条带,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达2021年第47卷第3期(总第423期)165㊀166㊀2021Vol.47No.3(Total 423)1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%㊂说明5种动物源性成分检测灵敏度可达到1%㊂在实际市场中,1%廉价肉的掺杂对于商贩来说毫无利润,因此检测限足够低,完全满足检测要求㊂a-猪引物的特异性;b-牛引物的特异性;c-羊引物的特异性;d-鸡引物的特异性;e-鸭引物的特异性M-marker;1-猪肉(121ħ30min);2-牛肉(121ħ30min);3-羊肉(121ħ30min);4-鸡肉(121ħ30min);5-鸭肉(121ħ30min);6-空白对照图1㊀特异性试验琼脂糖凝胶电泳图Fig.1㊀Specific electrophoresis agarose gel electrophoresisa-猪源性成分;b-牛源性成分;c-羊源性成分;d-鸡源性成分;e-鸭源性成分M-marker;1-5%肉模拟罐头;2-2.5%肉模拟罐头;3-1%肉模拟罐头;4-空白对照(双蒸水)图2㊀灵敏性试验琼脂糖凝胶电泳图Fig.2㊀Agar gel electrophoresis of sensitivity test2021年第47卷第3期(总第423期)167㊀2.3㊀市售罐头样品检测结果以市售的罐头试样为检测对象,使用种属特异性引物对其DNA 模板进行PCR 扩增,PCR 扩增结果如图3所示㊂所有样品均扩增出特异性条带,且条带清晰整齐,亮度较大,空白对照为阴性㊂将上述PCR 产物进行测序,测序结果在NCBI 上进行BLAST 比对,比对结果见表2㊂通过对20个市售肉类罐头样品进行检测,发现除15#和16#猪肝午餐肉罐头和午餐肉罐头外,所有样品检测结果均与标签标注相一致,6.6%的样品标签标注成分与检测结果不符㊂15#和16#除检测出标签标注成分外,还检测出鸡源性成分,使用其他方法对其进行检测,均检测出鸡源性成分,考虑可能是由于生产过程中的污染或食品中添加鸡精等导致㊂本方法适用于肉类罐头中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源性成分的检测,且结果准确可靠,具有实际应用价值㊂a-猪源性成分的检测;b-牛源性成分的检测;c-羊源性成分的检测;d-鸡源性成分的检测e-鸭源性成分的检测M-marker;1-阳性对照;2-空白对照;3-红烧猪肉罐头;4-清蒸猪肉罐头;5-午餐肉罐头(清淡味);6-干崩羊肉罐头;7-咸牛肉罐头;8-五香肉丁罐头;9-火腿猪肉罐头;10-午餐肉;11-午餐肉罐头;12-回锅肉罐头;13-红烧猪肉罐头;14-火锅午餐肉罐头;15-普云午;16-高金午餐肉;17-猪肝午餐肉罐头;18-午餐肉罐头;19-精品红烧猪肉罐头;20-粉蒸肉罐头;21-火腿午餐肉罐头;22-云腿大片罐头图3㊀市售肉类罐头样品琼脂糖凝胶电泳图Fig.3㊀Agarose gel electrophoresis of canned meat samples表2㊀肉类罐头样品中动物源性成分检测结果Table 2㊀Test results of animal derived components in canned meat samples编号商品名称相似序列相似度/%鉴别结果标称原料检测结果1红烧猪肉罐头KJ746663.183Sus scrofa 猪猪2清蒸猪肉罐头KY964306.185Sus scrofa 猪猪3午餐肉罐头(清淡味)KJ746663.179Sus scrofa猪猪4干崩羊肉罐头LS992617.189Capra aegagrus 山羊肉山羊5咸牛肉罐头MK058749.1MK028749.18996Bos taurus Gallus牛肉㊁鸡骨泥牛㊁鸡168㊀2021Vol.47No.3(Total 423)续表2编号商品名称相似序列相似度/%鉴别结果标称原料检测结果6五香肉丁罐头KY964306.193Sus scrofa 猪猪7火腿猪肉罐头MF183224.181Sus scrofa 猪猪8午餐肉MF183224.180Sus scrofa 猪猪9午餐肉罐头KY964306.181Sus scrofa 猪猪10回锅肉罐头MF183224.191Sus scrofa 猪猪11红烧猪肉KY964306.187Susscrofa猪猪12火锅午餐肉罐头KJ746663.1MH879470.18698Sus scrofa Gallus 猪㊁鸡猪㊁鸡13午餐肉罐头MF183224.180Sus scrofa 猪猪14高金午餐肉KF971862.1MH879470.18999Sus scrofa Gallus 猪㊁鸡猪㊁鸡15猪肝午餐肉罐头KF971862.1MH879470.18999Sus scrofa Gallus 猪猪㊁鸡16午餐肉罐头KJ746663.1MH879470.19098Sus scrofa Gallus 猪猪㊁鸡17精品红烧猪肉罐头KJ746663.192Sus scrofa 猪猪18粉蒸肉罐头KJ746663.195Sus scrofa 猪猪19火腿午餐肉罐头KJ746663.187Sus scrofa 猪猪20云腿大片罐头KJ746663.192Susscrofa猪猪3㊀结论本研究根据不同物种之间线粒体DNA 的差异,从数据库中筛选出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种常用肉类的特异性扩增引物,建立了种属特异性PCR 鉴别肉类罐头中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭成分的方法㊂结果表明,该方法使用的5种引物种属特异性良好,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%,完全满足实际市场掺入量1%的要求,并成功应用于市售肉类罐头样品的掺假检测㊂该方法操作简便,检测成本低,结果准确可靠,具有实际应用价值,适用于高温高压加工的肉类罐头样品的掺假鉴别,可以作为肉类罐头市场监督和检验鉴别的可行性办法,为实现深加工肉类产品消费市场健康发展,维护消费者权益提供了科学的依据㊂参考文献[1]㊀BALLIN N Z,VOGENSEN F K,KARLSSON A H.Species determi-nation-can we detect and quantify meat adulteration?[J].Meat Sci-ence,2009,83(2):165-174.[2]㊀WANG R F,MYERS M J,CAMPBELL W,et 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Moreover,the sequencing results were verified by using the BLAST comparison on NCBI to confirm the accuracy of the experiment,and the commercially available canned samples were also been tested.In this method,the five animal introduced species have good specifici-ty,the detection sensitivity for derived components of pork,beef,mutton and duck could reach1%,and the detection sensitivity for chicken-derived components was2.5%.After testing the commercially available samples,it was clear that in6.6%of the samples,the actual composition did not match the label.This method was easy to operate,low in cost,accurate,reliable,which could be widely used in the identification of five animal-derived components of pigs,cattle,sheep,chickens and ducks in canned meat and long-term high-tem-perature processed foods.Above all,it had extensive value in applications.Key words㊀canned meat;adulterated meat;mitochondria;animal-derived ingredient;food authenticity;species-specific PCR2021年第47卷第3期(总第423期)169㊀。

动物源性成分

饲料中动物‎源性成分检‎测技术研究‎进展摘要:饲料安全与‎动物生产、环境污染和‎人类健康密‎切相关。

动物废弃物‎进入饲料行‎业曾经弥补‎了蛋白质饲‎料不足的缺‎口,但却带来了‎新的问题。

饲料中动物‎源性成分的‎定性或定量‎检测技术已‎成为国内外‎的研究热点‎，适用于各种‎样品、基于各种原‎理的方法和‎技术被开发‎出来。

本文以组织‎学特征为基‎础的显微镜‎分析方法、以蛋白质和‎D N A为基‎础的免疫学‎和P CR分‎析方法、高效液相色‎谱法和近红‎外光谱法在‎动物源性饲‎料组分中的‎研究应用进‎展等方面做‎了综述,并对其发展‎趋势进行讨‎论。

饲料安全已‎与动物生产‎、环境污染和‎人类健康密切相关。

动物源性副‎产品因富含‎蛋白质、钙、磷等营养成分而‎被应用于畜‎禽饲料中, 但现有的证‎据表明, 在动物饲料‎中添加未经‎加热处理牛‎源性饲料或‎感染过痒病‎因子的牛( 羊) 肉/ 肉骨粉( MBM) 后能够引发和传播‎疯牛病( BSE)。

我国于19‎99、2001和‎2004年‎先后下发了关于‎对动物源性‎饲料生产和‎管理的相关‎条例, 主要对反刍‎动物源性饲‎料组分、MBM、肉粉、骨粉、血粉、动物内脏干‎粉和动物废‎弃物等使用‎做了严格的规定。

目前关于饲‎料中动物源‎性成分检测‎主要以样品的组‎织学特性和‎品种特异性‎的生物标记‎物( 如蛋白质、DNA和其‎他生物大分‎子等) 为对象, 其中PCR技‎术发展迅速‎, 已逐步被世‎界各国采用‎。

但由于动物源‎性饲料组成‎上的复杂性‎, 单一的PC‎R技术仍不能克‎服耗时、效率低和假‎阳性等问题‎。

因此,研究并建立‎一种( 套) 快速、灵敏、可靠的动物‎源性饲料检测技术‎, 对于提高饲‎料质量、防止饲料掺‎假、控制进口饲料‎安全和制订‎相关饲料法‎规等均具有‎重要意义。

本文中动物‎源性成分是指动物组‎织以及蛋和‎奶，包括肉类及‎其制品(含动物脏器)、水生动物产‎品等，检测技术是‎指上述成分‎中蛋白质和DN‎A等具有种‎间特异性物‎质的物种鉴‎定和含量分‎析技术。

PCR-mtDNA技术鉴别检测肉食品和饲料中鸭源性成分的研究

PCR-mtDNA技术鉴别检测肉食品和饲料中鸭源性成分的研究PCR-mtDNA技术鉴别检测肉食品和饲料中鸭源性成分的研究鸭肉作为一种优质的食用肉类，深受广大消费者喜爱。

然而，市场上竞争激烈的现实也导致了一些不法商家利用廉价的肉类替代鸭肉，以牟取不义之财。

为了确保市场上的食品安全，保护消费者的权益，科学家们利用PCR-mtDNA技术，开展了鸭源性成分的鉴别检测研究，追溯鸭肉的真实来源。

PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种重要的分子生物学技术，通过扩增DNA的特定区域，可以在复杂的样品中极其敏感地检测到目标物质的存在。

而mtDNA（线粒体DNA）作为细胞中独立于核DNA的遗传物质，在物种间普遍存在着高度的序列差异，使得它成为物种鉴别和亲缘关系分析的重要标志物。

因此，利用PCR-mtDNA技术可以准确鉴定出食品中的鸭源性成分。

首先，研究人员需要从肉食品和饲料样品中提取出DNA。

这一步骤是关键，因为提取出的DNA质量直接影响到后续PCR反应的准确性。

为了避免DNA的降解，研究人员需要采取一系列严谨的措施，包括消毒操作、低温保存等。

然后，利用PCR技术，选择适当的鸭mtDNA基因片段作为扩增目标，进行PCR扩增反应。

通过对PCR产物进行电泳分析，可以确定是否存在鸭源性成分。

同时，为了确认PCR产物的特异性，研究人员还需要设计合适的阳性对照和阴性对照，确保结果的可靠性。

在实际应用中，人们通常将PCR-mtDNA技术应用于市场上买到的肉制品中，以检测是否掺入了其他禽类的成分。

根据研究的结果，产品可以被分为纯正的鸭肉制品、含掺杂的产品以及完全没有鸭源性成分的伪造品。

因此，对于纯正的鸭肉产品，我们可以放心食用；而对于掺杂的产品，消费者可以根据自己的需求和偏好做出购买决策；对于伪造品，我们则需要加强监管，打击生产和销售假冒伪劣产品的不法行为。

PCR-mtDNA技术的应用使得我们能够追溯食品的真实来源，并保护消费者的权益。

PCR技术及其在动物科学领域的运用

PCR技术及其在动物科学领域中的运用摘要：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

近年来，PCR技术迅速发展并与其他技术结合衍生出了荧光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物学、医学、免疫学等领域。

本文通过介绍PCR技术及其在动物科学领域中的运用，使读者对PCR技术有初步的了解并对其运用领域有概况性的认识，更是为了今后的科学研究积累了更多的知识和提供了技术上的支持。

关键词：荧光定量PCR RT-PCR 探针引物（一）PCR技术简介及其运用概述聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。

聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。

聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

1、PCR技术原理双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝，在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

2、PCR工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA 聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分陆俊贤;唐修君;樊艳凤;贾晓旭;葛庆联;顾荣;王珏;高玉时【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)010【摘要】以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法;并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释,检测其灵敏度.结果显示,该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高,可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分.【总页数】4页(P110-112,172)【作者】陆俊贤;唐修君;樊艳凤;贾晓旭;葛庆联;顾荣;王珏;高玉时【作者单位】中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125【正文语种】中文【相关文献】1.利用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分研究 [J], 张晶鑫;高玉时;樊艳凤;唐修君;贾晓旭;顾荣;陆俊贤2.实时荧光定量PCR鉴别食品中猪源性成分的研究进展 [J], 高琳3.实时荧光定量 PCR 检测畜禽肉制品中鸭源性成分 [J], 林彦星;花群义;曹琛福;张彩虹;阮周曦;刘建利;宗卉;廖立珊;孙洁;杨俊兴;吕建强4.基于锁式探针的荧光定量PCR技术快速检测肉制品中鸭源性成分 [J], 满岳[1];王溪桥[1];周小平[1];Nazariyah Yahaya[2];丁功涛[3];李冰[4]5.利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究 [J], 张晶鑫;樊艳凤;唐修君;贾晓旭;高玉时;顾荣;陆俊贤;王珏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。