几种中药复方对胰岛细胞凋亡_坏死的影响

关 键 词 ： 含 药 血 清 ； 胰 岛 细 胞 ； 凋 亡 ； Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ 法 中 图 分 类 号： Ｒ２８５．５ 文 献 标 识 码： Ａ 文 章 编 号 ： １００４－ ５６２７（ ２００７） ０４－ ００２８－ ０２
中医药治疗糖尿病已有几千年的历史， 生脉 散 、玉 液 汤 、复 方 丹 参 、石 斛 合 剂 ［１］ 等 中 药 复 方 均 有 预 防 、治 疗 糖 尿 病 或 减 轻 慢 性 并 发 症 的 作 用 。随 着对糖尿病发病机制的深入研究， 已有多项研究 ［２］ 表 明 ， 胰 岛 β细 胞 凋 亡 在 糖 尿 病 的 发 生 和 发 展 中起到至关重要的作用。因此， 抑制胰岛 β细胞的 过度凋亡， 保持胰岛细胞的数量平衡， 是糖尿病治 疗的一个新方向。本文通过 ＭＴＴ， Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ 法 检 测 石 斛 合 剂 、复 方 丹 参 、生 脉 散 、玉 液 汤 等 几 种 中药复方含药血清对体外培养胰岛细胞凋亡的影 响， 阐述中药的分子药理学机制， 并寻找有效的抑 制 β细胞凋亡的方药。 １材料 １．１ 试 剂 双 硫 腙 由 Ｓｉｇｍａ 公 司 提 供 ； 链 脲 佐 菌 素 由 Ａｌｅｘｉｓ 公 司 提 供 ； Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ 试 剂 盒 由 晶 美 生 物 工 程 有 限 公 司 提 供 ； ＭＴＴ 由 美 国 ＢＩＣ－ ＭＯＬ 公司提供； 石斛合剂由石斛、黄芪、枸杞、五味 子 ４ 味中药组成； 复方丹参由丹参 １５ ｇ， 降香 １５ ｇ 组 成 ； 生 脉 散 由 人 参 １０ ｇ， 麦 冬 １５ ｇ， 五 味 子 ６ ｇ 组 成； 玉液汤由 生山药 ３０ ｇ， 生黄 芪 １５ ｇ， 知 母 １５ ｇ， 生 鸡 内 金 ６ ｇ， 葛 根 ４．５ ｇ， 五 味 子 ９ ｇ， 天 花 粉 ９ ｇ 组成。各中药复方制成含生药 １ ｇ ／ｍｌ 的水煎液。 １．２ 动物 １８０～２２０ ｇ ＳＤ 大鼠 ５０ 只， ３０～５０ ｇ ＳＤ 乳鼠 ３０ 只 ， 由福建医科 大学动物中 心提供， 合 格证书： 闽字 ０００００３９ 号。 ２方法 ２．１ 含药血清制备 取正常 ＳＤ 大鼠 ５０ 只， 按体 重随机分为 ５ 组， 每组 １０ 只， 雌雄各半。按 １ ｍｌ ／ １００ｇ 分 别 给 予 石 斛 合 剂 、复 方 丹 参 、生 脉 散 、玉 液 汤水煎液灌胃， 每日 １ 次， 连续给药 ６ ｄ， 按常规方 法 ［３］ 制 备 含 药 血 清 。 临 用 前 将 血 清 用 ＲＰＭＩ－ １６４０
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亏损， 牙齿失于濡养， 故酸软， 咀嚼无力而发生齿 楚。根据中医药理论， 治法应以益肾健骨， 疏风止 痛为主。方中黄芩能泻实火、除湿热； 骨碎补补骨、 活 血 ， 治 肾 虚 久 泻 、齿 痛 ； 细 辛 祛 风 、散 寒 ， 其 芳 香 走窜， 有较强之穿透力， 能进入牙齿， 散其内郁之 风热； 蝉蜕息风， 平肝镇惊， 镇风热加强镇痛之效； 延胡索活血、散瘀、理气、止痛。诸药合用， 具有益
培养基配成 １０％的含药血清溶液， 经 ０．２２ μｍ 滤 膜过滤除菌后分装， ４℃保存备用。 ２．２ 体外培养胰岛细胞 参照薛耀明等［４］ 方法， 用乳鼠制备胰岛细胞并培养 ７ ｄ 后， 经双硫腙染 色， 胰岛细胞纯度大于 ８５％， 可以用于实验。 ２．３ 实验分组 将原代培养 ７ ｄ 的胰岛细胞分 为 ６ 组， 每组 ６ 个复孔， 每孔细胞数为 １０６ 个。Ａ、 Ｂ ２ 组加入 ２．０ ｍｌ 含 １０％ 正常大鼠血清的培养基 中孵育 ２４ ｈ， Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ 组细 胞分别 加 入 ２．０ ｍｌ 含 １０％石 斛 合 剂 、复 方 丹 参 、生 脉 散 、玉 液 汤 含 药 血 清的培养基中孵育 ２４ ｈ 后， Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ 各组再加 入含 ２．０ ｍｌ １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ［５］ 的 培养基中培 养 ２４ ｈ。正常组 （ Ａ 组） ： 正常胰岛细胞加 １０％正常大鼠 血 清 ； 模 型 组 （ Ｂ 组 ） ： 正 常 胰 岛 细 胞 加 １０％ 正 常 大鼠血清加 １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ； 石 斛 合 剂 组 （ Ｃ 组 ） ： 正 常 胰 岛 细 胞 加 １０％ 石 斛 合 剂 含 药 血 清 加 １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ； 复 方 丹 参 组 （ Ｄ 组 ） ： 正 常 胰 岛 细 胞 加 １０％复 方 丹 参 含 药 血 清 加 １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ； 生 脉 散 组 （ Ｅ 组 ） ： 正 常 胰 岛 细 胞 加 １０％生 脉 散 含 药 血 清 加 １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ； 玉 液 汤 组 （ Ｆ 组 ） ： 正 常 胰 岛 细 胞 加 １０％ 玉 液 汤 含 药 血 清 加 １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ。 ２．４ ＭＴＴ 法 ［６］ 测 定 各 组 胰 岛 细 胞 的 ＯＤ 值 ， 间 接反映各组胰岛细胞的存活率。 ２．５ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ 法 测 定 将 各 组 胰 岛 细 胞 按 说 明 书 操 作 ， 使 用 流 式 细 胞 仪 （ ＦＡＣＳ） 分 析 ， 测 定 各 组 细 胞 的 存 活 、凋 亡 、坏 死 率 。 ２．６ 数 据 统 计 使 用 ＳＰＳＳ １２．０ 软 件 Ｏｎｅ－ Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ 进 行 数 据 处 理 ， 先 行 方 差 齐 性 检 验 ， 方 差 齐 ， 采 用 ＬＳＤ 进 行 组 间 比 较 ， 方 差 不 齐 ， 采 用 Ｇａｍｅｓ－ Ｈｏｗｅｌｌ 进行组间比较， 结果采用均数±标
福 建 中 医 学 院 学 报 ２００７ 年 ８ 月 第 １７ 卷 第 ４ 期
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Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＴＣＭ Ａｕｇｕｓｔ ２００７， １７（ ４）
几种中药复方对胰岛细胞凋亡、坏死的影响
郑燕芳 １， 施 红 ２， 王晓宁 ２
（ １． 福 建 中 医 学 院 药 学 系 ， 福 建 福 州 ３５０１０８； 福 建 中 医 学 院 中 西 医 结 合 系 ， 福 建 福 州 ３５０１０８）
收稿日期 ： ２００７－ ０３－ １９ 基 金 项 目 ： 福 建 省 自 然 基 金 资 助 项 目 （ Ｃ０５１００２５） 作 者 简 介 ： 郑 燕 芳 （ １９７８— ） ， 女 ， 助 教 ， 硕 士 。
第４期
郑燕芳等： 几种中药复方对胰岛细胞凋亡、坏死的 ３．１ 各组细胞的 ＯＤ 值比较 用 ＳＴＺ 造 模的 Ｂ， Ｃ， Ｄ， Ｅ， Ｆ 组 ＯＤ 值 与 Ａ 组 比 较 显 著 降 低 ， 提 示 ＳＴＺ 损 伤胰岛细 胞， 使其活性 降低； 用含药 血 清 保 护的 Ｃ， Ｄ， Ｅ， Ｆ 组 ＯＤ 值与 Ｂ 组比 较显著 升 高 ， 提 示含药血清保护胰岛细胞， 使其活性提高， 其中复 方丹参组的细胞活性较其它各治疗组高， 见表 １ 。
肾 补 骨 、散 风 、止 痛 之 功 效 ， 是 治 疗 牙 本 质 过 敏 的 良方。
本 实 验 将 以 上 各 中 药 方 的 水 煎 液 给 ＳＤ 大 鼠 灌胃， 制备含药血清， 将体外培养的胰岛细胞用含 药血清保护后， 加入 １．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＳＴＺ 诱导胰岛细 胞凋亡， 通过 ＭＴＴ， Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ 法检测各含药血 清对 ＳＴＺ 诱导的胰岛细胞凋亡和坏死的影响。根
据 ＭＴＴ 法 显 示 各 组 含 药 血 清 均 能 不 同 程 度 地 提 高 胰 岛 细 胞 活 性 ， Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ 法 测 出 各 组 含 药 血清对胰岛细胞的凋亡和坏死均有一定程度的抑 制 作 用 。我 们 推 断 石 斛 合 剂 、复 方 丹 参 、生 脉 散 、玉 液汤等中药复方可能通过抑制胰岛细胞凋亡和坏 死 ， 保 护 胰 岛 细 胞 ， 从 而 起 到 预 防 、治 疗 糖 尿 病 的 作用。
６
０．３３７０±０．０１５５１） ２）
生脉散组（ Ｅ）
６
０．２７７８±０．０１１４１） ２）
玉液汤组（ Ｆ）
６
０．２８８４±０．０１０２１） ２）
注 ： 与 正 常 对 照 组 比 较 ， １） Ｐ＜０．０１； 与 模 型 对 照 组 比
较， ２） Ｐ＜０．０１
３．２ 各组细胞的存活、凋亡、坏死率比较 用 ＳＴＺ 造 模 的 Ｂ， Ｃ， Ｄ， Ｅ， Ｆ 组 存 活 率 与 Ａ 组 比 较 显 著 降 低 ， 凋 亡 、坏 死 率 显 著 提 高 ， 提 示 ＳＴＺ 促 进 胰 岛细胞凋亡和坏死， 使其活性降低； 用含药血清 保护的 Ｃ， Ｄ， Ｅ， Ｆ 组存活率与 Ｂ 组比较显著升高， 凋亡、坏死率显著降低， 提示含药血清抑制胰岛 细 胞的凋亡和坏死， 见表 ２。 ４结论
参考文献： ［ １］ 施红， 林求诚， 陈国强， 等． 石斛合剂对 ２ 型糖尿病的临床疗
效 观 察 ［ Ｊ］ ． 中 药 新 药 与 临 床 药 理 ， ２００２， １３（ ６） ： ３４８－ ３５０． ［ ２］ Ｂｕｔｌｅｒ Ａ Ｅ， Ｊａｎｓｏｎ Ｊ， Ｂｏｎｎｅｒ Ｗｅｉｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ． β－ ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｃｉｔ ａｎｄ
表 ２ 各 组 细 胞 的 存 活 、凋 亡 、坏 死 率 比 较 （ ｘ±ｓ， ％）
组别 ｎ
存活率
凋亡率
坏死率
Ａ ６ ９０．９４±０．５２
６．１４±０．５６
２．９２±０．２１
Ｂ ６ ５３．６０±１．５８１） ３２．９６±１．２３１） １３．４５±０．７２１）
Ｃ ６ ７２．０９±１．５９１）２） １９．９８±０．９０１）２） ７．９３±０．７９１）２）
表 １ 含 药 血 清 对 胰 岛 细 胞 活 性 影 响 的 比 较 （ ｘ±ｓ）
组别
ｎ
ＯＤ 值
正 常 对 照 组 （ Ａ）
６
０．４４５６±０．０１２９
模 型 对 照 组 （ Ｂ）
６
０．２２４６±０．００９５１）
石 斛 合 剂 组 （ Ｃ）
６
０．２８８６±０．０１２９１） ２）