水稻条纹病毒胁迫下的水稻全基因组表达谱

水稻条纹病毒胁迫下的水稻全基因组表达谱1张晓婷，谢荔岩，林奇英，吴祖建*，谢联辉*福建省植物病毒学重点实验室，福建农林大学植物病毒研究所，福建福州（350002)E-mail：zhangxiaoting921@摘要：水稻条纹叶枯病由水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）引起，对我国水稻生产危害严重。

为了明确RSV侵染对水稻基因表达谱的影响，采用Affymetrix水稻全基因组芯片对RSV接种后出现条纹症状第7天的武育粳3号水稻病叶和相应的健康叶片进行了全基因组表达谱分析，得到3517个差异基因，其中2002个表达上调，1515个表达下调。

根据TIGR数据库注释（/tdb/e2k1/osa1/）和MIPS基因功能分类标准（http://mips.gsf.de/projects/funcat）将差异基因归类为15个功能类别，多数差异基因与植物防御、信号传导及蛋白质、碳水化合物的代谢相关，一些转录因子的表达也发生了明显的变化。

代谢途径分析表明，RSV侵染后磷酸戊糖途径、类黄酮合成途径和芸苔素合成途径的相关基因表达明显增强，赤霉素合成途径相关基因的表达受到了抑制。

关键词：水稻条纹病毒，基因表达谱，代谢途径分析中图分类号：S432.1；S11+7水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）是纤细病毒属（Tenuivirus）的代表种，基因组由4条单链RNA组成，具有独特的基因组编码策略[1－3]。

其所致的水稻条纹叶枯病在我国多个省份广泛分布 [4]，是当前我国水稻生产上最重要的病害之一。

该病的症状主要是心叶褪绿、捻转下垂，病叶褪绿斑驳[5]。

细胞超微结构研究表明，RSV侵染后的水稻叶肉细胞中线粒体明显增多，细胞核变大，叶绿体结构因症状严重度不同而有不同程度的破坏，并有淀粉粒的积累，叶肉细胞间及叶肉细胞与微管束细胞间胞间连丝明显增多，细胞质中出现蛋白体[6、7]。

病毒是严格的细胞内寄生生物，其侵染后不但干扰寄主的正常生长代谢，引起细胞形态的明显改变，还将利用寄主蛋白进行复制和增殖，导致其基因表达谱的巨大改变。

Senthil 等比较了苦苣菜黄脉病毒（Sonchus yellow net virus，SYNV）和凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus，INSV）侵染烟草不同时期后寄主的基因表达谱变化，发现在INSV侵染后2、4、5天分别有275、2646和4165个差异表达基因，SYNV侵染后5、11、14天分别有35、665和1458个基因差异表达 [8]。

Whitham等研究了5种RNA病毒侵染后拟南芥的基因表达谱，得到114个可能在多种RNA病毒与寄主互作中起普遍作用的基因，并将它们归类于8个功能类别 [9]。

高通量研究方法如基因芯片技术等可以为植物病毒与寄主的互作分析提供丰富的信息。

但相关研究多集中在烟草、拟南芥等双子叶植物，单子叶植物与病毒互作的基因表达谱研究相对较少。

Ventelon-Debout等通过构建cDNA文库研究水稻黄斑驳病毒（Rice yellow mottle virus, RYMV）侵染后的水稻基因表达谱，得到5549个水稻表达序列标签（EST），发现病毒侵染后能量代谢和光合作用相关的基因表达发生了变化[10]。

2007年Takumi Shimizu等首次报道了禾本科模式植物水稻与水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus，RDV）互作的基因表达谱变化，得到686个差异表达基因 [11]。

为了明确RSV侵染后寄主的基因表达谱变化，深入了解单子叶植物寄主对多分体负单链RNA病毒的响应机制，我们选用对RSV高度敏感的水稻品种“武育粳3号”进行试验，以未经处理的健康植株为对照组，显症后一周的水稻条纹病株为实验组，分别与Affymetrix1本课题得到国家973项目（2006CB100203）；国家自然科学基金项目（30671357）；教育部博士点基金项目（20040389002，20050389006）的资助。

公司的水稻全基因组芯片进行杂交，系统分析其基因表达谱差异，以期为开创新的抗病策略奠定基础。

1.材料和方法1.1供试材料水稻品种是江苏省武进县稻麦育种场繁育的“武育粳3号”，RSV毒源为保存于本所的洪泽分离株，介体昆虫是采自江苏洪泽田间的无毒灰飞虱后代，水稻全基因组寡核苷酸芯片Genechip Rice genome array购自Affymetrix公司。

1.2生物学接种按常规生物学方法用生长至二叶一心期的稻苗进行病毒接种。

在出现条纹症状的第7天，分别剪取症状明显的病叶作为实验组，同时，从同一生长期的未接种健康植株上剪取相应的健康叶片作为对照组，在液氮中速冻，保存于－70℃备用。

1.3样品核酸的制备由北京博奥生物有限公司完成。

主要流程包括：用Invitrogen公司的Trizol试剂提取样品总RNA；以T7-Oligo(dT)为引物用SuperScriptII kit（Invitrogen）反转录合成双链cDNA；用Ambion公司的MessageAmp II－Biotin Enhanced Kit进行体外转录，合成生物素标记的cRNA并将其降解为35-200个碱基大小的cRNA片段，待于芯片杂交。

1.4芯片杂交、洗染和扫描本实验选用的Affymetrix Genechip Rice genome array共有探针57382套，包括了48564个粳稻和1260个籼稻序列信息，代表约46000个水稻基因，其中3’EST、mRNA转录本和全长cDNA克隆26000个，TIGR预测基因19431个。

芯片的杂交、洗脱、染色和扫描由北京博奥生物有限公司利用美国Affymetrix公司生产的“基因芯片检测工作站”专用设备完成。

1.5芯片数据分析利用Affymetrix GeneChip Operating Software Version 1.0（GCOS）软件对芯片扫描数据进行分析和处理。

首先对单张芯片进行背景校正，并采用默认参数进行归一化处理（Normalization），判断基因是否表达，然后分别比较对照组和实验组的芯片杂交信号，找出在两个材料的至少一个中表达且差异倍数大于2的探针组进行后续分析，具体方法见GCOS软件说明（https:///）。

1.6差异基因的功能分类根据Affymetrix网站NetAffy分析中心（https:///analysis/netaffx/）的基因注释和MIPS（http://mips.gsf.de/projects/funcat）[12]基因功能分类方案，将“武育粳3号”实验组和对照组表达差异在2倍以上的基因进行功能分类。

1.7代谢途径分析提取差异探针组所对应的基因位点号（Locus Identifier）（/tdb/e2k1/osa1/,TIGR）[13、14]，用pathway tools软件[15]分析其所参与的水稻代谢途径。

2. 结果与分析2.1 样品RNA 纯度和完整性检测所提取总RNA 经分光光度计测定，含量均大于1µg/µl ；D260/D280比值介于1.8-2.0之间；变性凝胶电泳检测28S 、18S 两个核糖体RNA 条带清晰可见，无拖尾现象，说明RNA完整性很好。

2.2 芯片检测质量判定“武育粳3号”对照组和实验组叶片RNA 与水稻全基因组芯片杂交芯片的扫描结果显示，芯片左上角有一清晰的“GeneChip Rice”字样，周点线均匀，四角的点和中间的“＋”字清晰，表明芯片质量可靠（图1）。

信号检测报告表明，两组芯片的背景值和噪音值都很低,且都很均匀，外加的阳性对照基因BIOC 、BIOB 、BIOD 及cre 均能检测到，质量控制有关数据见表1。

这些结果说明，本组基因芯片的质量和样品RNA 的提纯质量都很好，杂交和检测体系亦无问题，芯片检测结果可靠。

Fig.1 WuY un3 cRNA hybridization scanning. (a) one corner of GeneChip and “GeneChip Rice” symbol; (b)GeneChip central “+” symbol; (c) a part of hybridization scanning graph.Table 1 Expression report of hybridization with WuYun3 using Rice Whole Genome ArrayAvg Std Min Max Avg Std Min Max Backgroun 33.19 0.3 32.7 34.2 32.8 0.19 32.2 33.3Noise 1.27 0.04 1.2 1.41.17 0.04 1.1 1.3 Spike control ： Probe Sig(5’) Det(5’) Sig(M’Det(M’)Sig(3’) Det(3’Sig(full) Sig(3’/5’)全AFFX-B373.6 P 701.8P 543.2 P 539.53 1.45 AFFX-B1081.7 P 1243.2 P 1162.45 1.15 AFFX-B4961 P 5569.9 P 5265.45 1.12 RSV-treate d AFFX-C17025.8 P 22242 P 19633.9 1.31 AFFX-B487.1 P 736.4P 568.9 P 597.46 1.17 AFFX-B1320 P 1459.1 P 1389.55 1.11 AFFX-B5669 P 6535.2 P 6102.10 1.15 Control AFFX-C 20123.2 P 26212.7P 23167.9 1.30BIOB, BIOC and BIOD represent genes involved in the biotin synthesis pathway of E. coli. CRE is therecombinase gene from P1 bacteriophage2.3样品检测结果利用Affymetrix GCOS软件分析“武育粳3号”对照组和实验组与水稻全基因组芯片杂交后的扫描结果，发现在所有57382套探针中40％以上的基因转录本在“武育粳3号”叶片中表达，其中对照组中共检测到25656个基因转录本的表达，占总数的44.7%，平均信号值为520.8；实验组中共检测到26073个，占总数的45.4%，平均信号值为445.4（表2）。

Table 2 Number of genes expressed in RSV-treated WuYun3 and controlRSV-treated Control Chip IDNumber Percentage Number Percentage Number present 25656 44.7 26073 45.4Number absent 31103 54.2 30663 53.4Number marginal 622 1.1 645 1.1Total probe sets 57381 100 57381 100采用默认参数（https:///）比较归一化处理后的对照组和实验组芯片，共得到差异在2倍以上的基因转录本3517个，占靶标基因总数的19.8％。