改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法_石妍

作者简介:石　妍,女,1983年5月出生,黑龙江省哈尔滨市人,在读硕士研究生。

E-m a i l:s h i y a n y o y o@ 126.c o mA b o u tS H I Y a n:F e m a l e,b o r n i n M a y,1983.P o s t g r a d u a t e s t u d e n t.E-m a i l:s h i y a n y o y o@126.c o m收稿日期:2009-11-30修回日期:2010-04-08本文编辑:董建军■基金项目:黑龙江省科技攻关课题基金资助(编号:G C08C416);黑龙江省教育厅课题基金资助(编号: 11531177)作者单位:150001　黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学第一临床医学院眼科医院通讯作者:刘　平,E-m a i l:l i u p i n g53 @163.c o mR e c e i v e dd a t e:N o v30,2009A c c e p t e dd a t e:A p r8,2010F o u n d a t i o n i t e m:K e y S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y P r o g r a m o fH e i l o n g j i a n g P r o v i n c e(N o:G C08C416);F o u n d a t i o n b yH e i l o n g j i a n gP r o v i n c i a lE d u c a t i o n D e p a r t m e n t(N o:11531177)F r o mt h eE y e H o s p i t a l,t h e F i r s t A f f i l-i a-t e d H o s p i t a l o f H a r b i nM e d i c a l U n i-v e r s i t y,H a r b i n150001,H e i l o n g j i a n g P r o v i n c e,C h i n aR e s p o n s i b l e a u t h o r:L I U P i n g,E-m a i l:l i u p i n g53@163.c o m【实验研究】改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法■石　妍　杨　帆　葛红岩　刘　平I m p r o v e dm e t h o do fp r i m a r yc u l t u r ea n d p u r i f i c a t i o no f r a b b i t c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s S H I Y a n,Y A N GF a n,G EH o n g-Y a n,L I UP i n g【Ke y wo r d s】　c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s;e n t i r ec o r n e a;p r i m a r yc e l l c u l t u r e;p u r i f i c a-t i o n;r a b b i t【A b s t r a c t】　O b j e c t i v e　T o i m p r o v e t h e m e t h o do f p r i m a r y c u l t u r e a n dp u r i f i c a t i o no f r a b b i t c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s,a n dt oe n h a n c et h e s u c c e s s f u l r a t eo f p r i m a r yc u l t u r e. Me t h o d s　T h er a b b i t c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l sw e r ec u l t u r e db yt h ee n t i r ec o r n e a l t i s-s u e-c u l t u r e,p u r i f i e da n d p a s s a g e d b y t h e m e t h o do f m e c h a n i c a l c u r e t t a g e a n dd i f f e r e n t i-a l a d h e s i o n,t h e m o r p h o l o g yo f t h ec u l t u r e dc e l l s w a s ob s e r v e db yi n v e r t e dp h a s ec o n-t r a c t m i c r o s c o p e,a n dt h ec u l t u r e dc e l l s w e r ei d e n t i f i e db yi m mu n o h i s t o c h e m i c a l m e t h-o d.Re s u l t s　T h er a b b i te n t i r ec o r n e aa d h e r e di n24h o u r s,t h ec e l l sc o u l d b es e e nc l i m b i n g o u t f r o m t h ec o r n e a l l i m b u s f r o m48h o u r s l a t e r,a l a r g en u mb e r o f f i b r o b l a s t sa n de p i t h e l i a l c e l l sc o u l db es e e nc l i m b i n g o u ta nd c oe x i s t e d af t e r5d a y s,a n dt h eb o u n d a r i e s w e r ec l e a r;T h es t r a t i f i ede p i t h e l i a l c e l l sg r e w.T h ef i b r o b l a s t sb e f o r et h eb o u n d a r y f u s e dw e r ec u r e t t a g e d,t h e c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s s e q u e n t i a l g r e w s t r o n g l ya n dr e a c h e dc o n f l u e n c e a f t e r10d a y s.A f t e r p a s s a g e dt ot h e4t hg e n e r a t i o n,t h ec e l l sw e r es i g n i f i c a n t l yl a r g e r a n da g i n g.T h ec u l t u r e dc e l l ss t a i n e dp o s i t i v e l yf o r m o n o c l o n a l a n t i-b o d yP C Kb yi m m u n o h i s t oc h e mi c a l m e t h o d.C o n c l u s i o n s　T h ei m p r o v e dm e t h o do f p r i m a r y c u l t u r ea n dp u r i f i c a t i o no f c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s i s s i m p l e,e c o n o m i c s a n de f-f e c t i v e,b yi t t h eb e t t e rb i o l og i cp r o p e r t yo f c o r n e a l e p i th e li a l c e l l sc a nb eo b t a i n e d,w h i c he s t a b l i s ht h ee x p e r i me n t a l b a s i s f o r s t u d y i n g t h ec o r n e a a n dc o r n e a l d i s e a s e s.[R e cA d v O p h t h a l mo l2010;30(7):612-615]【中图分类号】　R394.2 【文献标志码】　A【文章编号】　1003-5141(2010)07-0612-04【关键词】　角膜上皮细胞;全角膜;原代细胞培养;纯化;兔【摘要】　目的　改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法,提高角膜上皮细胞原代培养的成功率。

方法　采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞,利用机械刮除和差速贴壁法进行纯化并传代,通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察并应用免疫组织化学的方法对细胞进行鉴定。

结果　兔全角膜24h贴壁,48h后即可见有细胞自角膜缘爬出,5d后细胞大量爬出可见成纤维细胞和角膜上皮细胞共存,界限明显;角膜上皮细胞复层生长。

在界限融合前刮除成纤维细胞,角膜上皮细胞继续旺盛生长,10d后达到融合。

兔角膜上皮细胞传至第4代后细胞体积明显变大,传至第5代,细胞衰老、凋亡。

兔角膜上皮细胞免疫组织化学显示P C K单克隆抗体阳性。

结论　改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法简单、经济、有效,并可获得具有良好生物学特性的角膜上皮细胞,为角膜及角膜疾病的研究奠定实验基础。

[眼科新进展　2010;30(7):612-615] 角膜位于眼球的最前端,分为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层,具有良好的透光性和屈光性。

角膜上皮是抵御病原微生物侵袭的第一道屏障,在一定程度上也能抵御化学物质的侵袭。

如果角膜上皮受损,其他各层则极易受损,导致角膜混浊甚至致盲。

因此,很多学者都致力于加快角膜上皮创伤愈合的研究[1]。

成功的角膜上皮细胞培养对于角膜上皮的基础研究、创伤愈合以及药物治疗等有重要价值。