DNA重组技术的基本工具(共32张PPT)
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基础理论和技术发展催生了基因工程
E·coliDNA连接酶
3)1977年DNA合成和测序技术的发明
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
——特异性
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序
列，并在G和A之间切开。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
• 限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特 大异多性数识限别制的酶切的割识部别位序都列具由
操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要 进行人工改造后才能用于基因工程操作。
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具 有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还 不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA 的酶。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
Haemophilus influenzae d )中先
后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
5.作用结果：
产生黏性末端或平末端
生物A基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
生物B基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
EcoRⅠ 酶切
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC…… ……CTTAA G……
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
SmaⅠ
被限制酶切开 的DNA两条单 链的切口是平 整的，这样的 切口叫平末端 。
平末端
平末端
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
⒈主要来源： 主要从原核生物中分离纯化 ⒉种类与命名： ⒊作用特点（特异性）
识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
⑵λ噬菌体的衍生物 ⑶动植物病毒
• 常用的载体：质粒
常存在于原核细胞中，是一种裸露的、结构简单、独立于拟 核之外能自我复制的很小的双链环状DNA分子。
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点
能复制并带着插 入的目的基因一 起复制
1
5
2
7
36 48
思考与探究 P7 （2）
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体 吗？为什么？
不能，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以 插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位 置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的
基因的插入而失活。
不同来源的DNA片段混合
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC…… ……CTTAAG……
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用:
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即 将脱氧核糖和磷酸连接起来。
2.作用原理：
催化磷酸二酯键形成
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或可整合到受体染色体 DNA
上随染色体DNA的复制而同步复制。
3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细 胞外的其他生物细胞中去。
5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便
6有个回核文苷序酸列组成：,在少切数割的识部别
序位列，由一4条、链5或正8向个读核的苷碱酸基组 成顺序与另一条链反向读的 顺序完全一致。
切割DNA分子实质是断开两个核
苷酸之间的磷酸二酯键。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
4.作用结果： 产生黏性末端或平末端
EcoR
Ⅰ限制 酶
被限制酶切开的 DNA两条单链的 切口，带有几个 伸出的核苷酸， 它们之间正好互 补配对，这样的 切口叫黏性末端 。
3. 种类：（1）E·coliDNA连接酶
（2）T4DNA连接酶
两种酶的区别：
类型
来源
相同点
功能
差别
E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶
大肠杆菌 恢复
磷酸
T4噬菌体 二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
作用特点 将单个核苷酸连接成一 缺口同时连接起来，不
条互补的DNA链
需要模板
相同点
形成磷酸二酯键
三、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
⒈ 运载体必备的条件： ⑴在受体细胞中能自我复制并稳定保存
⑵有1个至多个限制酶切割位点 ⑶有特殊的标记基因，便于鉴定和选择
⑷对受体细胞的生存无决定性作用
⒉ 常用运载体： ⑴质粒
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
⒈主要来源：主要从原核生物中分离纯化
思考
• 根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于 原核生物中的作用是什么吗？
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使 之失效，从而达到保护自身的目的。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
⒉ 种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
DNA聚合酶
DNA连接酶
模板 作用底物
需要
单个脱氧核苷酸
不需要
DNA分子片段
以一条DNA链为模板， 将DNA双链上的两个
专题1
基
因
工
程
基因工程的概念
基因工程的别名 操作环境
DNA重组技术 生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程 剪切 → 拼接 → 导入 → 表达
思 考：
自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物
的情况？ 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
基础理论和技术发展催生了基因工程 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其
DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序 列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的 碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细
菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断 ，并且可以防止外源DNA的入侵。
思考与探究 P7
大肠杆菌
EcoRⅠ （Escherichia coli R） 基础理论和技术发展催生了基因工程
5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）
4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。 这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
三、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车” 4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或可整合到受体染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
不同来源的DNA片段混合
1)1967年基因转移载体的发现
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生 物个体转移到另一种生物个体。
粘质沙雷氏杆菌
基础理论和技术发展催生了基因工程 4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
SmaⅠ （Serratia marcesens）
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1)1967年基因转移载体的发现
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( ……CTTAA G……
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
科技探索之路基础理Βιβλιοθήκη 和技术发展催生了基因工程基
础
克里克等提出中心法则
理
论
复制
转录
DNA
逆转录
翻译 RNA
（2）在特定的位点切割DNA分子。
6)1980年第一例转基因动物问世
基础理论和技术发展催生了基因工程
DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）
⑵λ噬菌体的衍生物
被限制酶切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。
噬菌体侵染细菌的实验。 识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
5)1973年重组DNA表达实验的成功 6)1980年第一例转基因动物问世 7)1988年PCR技术的发明
第一节 DNA重组技术的基本工具
一. 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） ——限制性核酸内切酶
二. DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） ——DNA连接酶
三. 基因转移工具（“分子运输车”） ——基因进入受体细胞的载体
蛋白质
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传 密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
1)1967年基因转移载体的发现 2)1970年工具酶的发现
3)1977年DNA合成和测序技术的发明 4) 1972年DNA体外重组的实现
E·coliDNA连接酶
3)1977年DNA合成和测序技术的发明
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
——特异性
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序
列，并在G和A之间切开。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
• 限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特 大异多性数识限别制的酶切的割识部别位序都列具由
操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要 进行人工改造后才能用于基因工程操作。
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具 有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还 不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA 的酶。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
Haemophilus influenzae d )中先
后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
5.作用结果：
产生黏性末端或平末端
生物A基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
生物B基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
EcoRⅠ 酶切
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC…… ……CTTAA G……
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
SmaⅠ
被限制酶切开 的DNA两条单 链的切口是平 整的，这样的 切口叫平末端 。
平末端
平末端
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
⒈主要来源： 主要从原核生物中分离纯化 ⒉种类与命名： ⒊作用特点（特异性）
识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
⑵λ噬菌体的衍生物 ⑶动植物病毒
• 常用的载体：质粒
常存在于原核细胞中，是一种裸露的、结构简单、独立于拟 核之外能自我复制的很小的双链环状DNA分子。
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点
能复制并带着插 入的目的基因一 起复制
1
5
2
7
36 48
思考与探究 P7 （2）
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体 吗？为什么？
不能，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以 插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位 置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的
基因的插入而失活。
不同来源的DNA片段混合
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC…… ……CTTAAG……
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用:
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即 将脱氧核糖和磷酸连接起来。
2.作用原理：
催化磷酸二酯键形成
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或可整合到受体染色体 DNA
上随染色体DNA的复制而同步复制。
3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细 胞外的其他生物细胞中去。
5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便
6有个回核文苷序酸列组成：,在少切数割的识部别
序位列，由一4条、链5或正8向个读核的苷碱酸基组 成顺序与另一条链反向读的 顺序完全一致。
切割DNA分子实质是断开两个核
苷酸之间的磷酸二酯键。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
4.作用结果： 产生黏性末端或平末端
EcoR
Ⅰ限制 酶
被限制酶切开的 DNA两条单链的 切口，带有几个 伸出的核苷酸， 它们之间正好互 补配对，这样的 切口叫黏性末端 。
3. 种类：（1）E·coliDNA连接酶
（2）T4DNA连接酶
两种酶的区别：
类型
来源
相同点
功能
差别
E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶
大肠杆菌 恢复
磷酸
T4噬菌体 二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
作用特点 将单个核苷酸连接成一 缺口同时连接起来，不
条互补的DNA链
需要模板
相同点
形成磷酸二酯键
三、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
⒈ 运载体必备的条件： ⑴在受体细胞中能自我复制并稳定保存
⑵有1个至多个限制酶切割位点 ⑶有特殊的标记基因，便于鉴定和选择
⑷对受体细胞的生存无决定性作用
⒉ 常用运载体： ⑴质粒
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
⒈主要来源：主要从原核生物中分离纯化
思考
• 根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于 原核生物中的作用是什么吗？
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使 之失效，从而达到保护自身的目的。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
⒉ 种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
DNA聚合酶
DNA连接酶
模板 作用底物
需要
单个脱氧核苷酸
不需要
DNA分子片段
以一条DNA链为模板， 将DNA双链上的两个
专题1
基
因
工
程
基因工程的概念
基因工程的别名 操作环境
DNA重组技术 生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程 剪切 → 拼接 → 导入 → 表达
思 考：
自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物
的情况？ 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
基础理论和技术发展催生了基因工程 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其
DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序 列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的 碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细
菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断 ，并且可以防止外源DNA的入侵。
思考与探究 P7
大肠杆菌
EcoRⅠ （Escherichia coli R） 基础理论和技术发展催生了基因工程
5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）
4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。 这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
三、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车” 4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或可整合到受体染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
不同来源的DNA片段混合
1)1967年基因转移载体的发现
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生 物个体转移到另一种生物个体。
粘质沙雷氏杆菌
基础理论和技术发展催生了基因工程 4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
SmaⅠ （Serratia marcesens）
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1)1967年基因转移载体的发现
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( ……CTTAA G……
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
科技探索之路基础理Βιβλιοθήκη 和技术发展催生了基因工程基
础
克里克等提出中心法则
理
论
复制
转录
DNA
逆转录
翻译 RNA
（2）在特定的位点切割DNA分子。
6)1980年第一例转基因动物问世
基础理论和技术发展催生了基因工程
DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）
⑵λ噬菌体的衍生物
被限制酶切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。
噬菌体侵染细菌的实验。 识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
5)1973年重组DNA表达实验的成功 6)1980年第一例转基因动物问世 7)1988年PCR技术的发明
第一节 DNA重组技术的基本工具
一. 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） ——限制性核酸内切酶
二. DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） ——DNA连接酶
三. 基因转移工具（“分子运输车”） ——基因进入受体细胞的载体
蛋白质
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传 密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
科技探索之路
基础理论和技术发展催生了基因工程
1)1967年基因转移载体的发现 2)1970年工具酶的发现
3)1977年DNA合成和测序技术的发明 4) 1972年DNA体外重组的实现