第七章 色谱分离技术

固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
是产品的最后纯化工序（精制），即在用色 谱纯化之前需要经过其他方法进行提取和初步 纯化。
近40年来，色谱技术已成为生物大分子分离 和纯化技术中极重要的组成部分。
胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长 激素等。
（1）原理： 利用混合物中各组分的物理化学性质的差异， 在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从 而达到分离的目的。
吸附剂：涂布在薄层板上 （固定相） 两 相 展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂
（流动相）
将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在密 闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开。
当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和展开剂之 间发生连续不断的吸附、解吸附、再吸附、再解 吸附。
概述 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 高效液相色谱法 亲和色谱法
一、概述
1.发展史
创始人：茨维特（Tsweet）1906 纸色谱
石油醚
植物色 素的石 油醚提 取液
菊根粉或 碳酸钙
薄层色谱
连续色带—色层或色谱 色谱法得名
气相色谱
高效液相色谱 离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱
2.色谱法的特点
两性电解质（蛋白质、氨基酸）在不同溶液中 所带的净电荷的种类和数量不同：
pH = pI; pH < pI； pH > pI ?
溶液pH偏离pI越远，则净电荷量越大。
由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同， 可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与 离子交换树脂的吸附作用，从而将它们分离。
离子交换树脂（固定相）的性质、种类、选择 依据、离子交换色谱的操作及应用
以下物质：杂质与目的物间的溶解度、分子大小、 电荷分布等性质差异小，相对含量低，其他经典 手段分离有困难的高分子物质；尤其是对分离某 些不稳定的高分子物质更具有优越性。 如：酶、rRNA、抗原和抗体的分离，激素的提纯
② 分离纯化各种功能细胞、细胞器、膜片段和 病毒颗粒
③ 用于各种生化成分的分析检测 ④ 与亲和色谱有关的特殊技术应用
应用最广泛的一类凝胶。 由葡聚糖Dextran交联而得。
在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度 不同的凝胶。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫 做交联度。
交联度大：网状结构紧密，吸水量小 交联度小：网状结构疏松，吸水量多
化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液
2. 琼脂糖凝胶
来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶， 不是共价交联，而是以氢键交联，键能较弱。
（2）吸附剂和展开剂的选择： 吸附剂：氧化铝、硅胶和聚酰胺
固定相对各组分吸附力的大小次序：
（2）分类
操作方法 的不同
吸附薄层色谱法 柱色谱法
5.吸附薄层色谱法 （thin layer chromatography, TLC） 薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在 玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品 点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最 后使样品中各组分得到分离。
① 目的产物的分子结构、物理化学性质及相对 分子质量；
② 主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特 性与目的产物相近的杂质成分与含量；
③ 目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳 定性。
四、离子交换色谱法
与离子交换法的区别？
离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静 电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂 上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗 脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。
分子洗脱
载体 配基
亲和物 杂质
亲和层析
再生
洗脱
+
洗涤
（二）亲和吸附剂的制备
载体的选择 配基的选择 载体的活化与偶联
1.载体的选择
① 具有较好的理化稳定性和生物惰性 ② 具有大量可供活化和配基结合的化学基团 ③ 高度的水不溶性和亲水性 ④ 有稀松的网状结构使大分子能自由进入 ⑤ 有良好的机械性能，颗粒均匀
由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同： 对极性大的物质吸附力强， 对极性小的物质吸附力弱。
移动速度的不同： 易被吸附的物质相对移动较慢，在薄层板上移 动的距离就小； 较难被吸附的物质移动较快，移动的距离大。
经过一段时间的展开，不同物质就被彼此分开， 最后形成互相分离的斑点。
将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，用特 定的方法使斑点显色，达到定性和定量的目的。
4、样品处理和加样（样品的浓度、黏度） 5、洗脱与收集（洗脱液的成分、流速、目的物） 6、凝胶的保存（去除杂质）
七、亲和色谱法
亲和色谱法：利用生物大分子与某些对应的 专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起 来的一种色谱方法。
如抗原与抗体，酶与底物，激素与受体等
广泛用于酶、抗体、核酸、激素等的分离与 纯化，特别是对含量极少而又不稳定的活性物 质最有效。
人工合成，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。 对芳香族、杂环化合物有不同程度的吸附作用。
凝胶的预处理
（三）操作方法
层析柱的选择 凝胶柱的装填
样品处理和加样
洗脱与收集 凝胶的保存
1、凝胶的预处理：充分溶胀
2、层析柱的选择 ① 体积 ② 柱比：层析柱的长度与直径的比 （样品的数量、性质、分离目的）
3、凝胶柱的装填 进胶过程宜连续、均匀、不中断，并不断搅拌。
（一）基本原理
亲和色谱是应用生物分子对它的互补结合体 （配基）的生物识别能力，使目标产物得以分离
纯化的液相层析法。
配基的固定化
具有亲和力的两个分子中的一个 （配基）以共价键形式与不溶性 载体相连作为固定相吸附剂
吸附样品
样品（流动相）流经层析柱时， 配基选择性吸附目的分子，杂质 不能被吸附而流出。
样品解析（洗脱） 选择适宜的条件将被吸附的目的
（1）概念 色谱法是一种物理的分离方法，利用不同物
质在两相中具有不同的分配系数，并通过两相 不断的相对运动而实现分离的方法。
其中一相是固定相，通常是表面积很大的或 多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。
流动相流经固定相时，由于物质在两相间的 分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离； 或者说，易分配于固定相中的物质移动速度慢， 易分配于流动相中的物质移动速度快，因而逐 步分离。
离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多， 在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。
电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸 附。
3.常用的吸附剂：
按 化 学
有机吸附剂：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、
聚酰胺
结
构 无机吸附剂：氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙、
分
氢氧化铝
4.吸附色谱的基本过程和分类 （1）过程
（四）操作方法
亲和层析的基本过程：
具有亲和力的一对分子中的一个作为配基，与 不溶性载体结合，使之固化，装入色谱柱
含目的物的混合液作为流动相进入色谱柱，配 基选择性吸附目的物质，杂质不能被吸附而直 接流出。
改变条件使配基与其亲和物解离
具体操作：
① 样品制备 含杂质，需预处理：蛋白沉淀、离子交换柱层析 ② 配体与配基结合条件的选择
操作方法
柱色谱法 纸色谱法
薄层色谱法 气相色谱法
流动相的物态
液相色谱法
实验技术
迎头法 顶替法 洗脱分析法
4.色谱分离方法的选择
初级代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、
目
单糖类、脂肪酸
的 次级代谢产物：生物碱、萜类、糖苷、色素、
产
鞣质类、抗生素
物
生物大分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖
色谱分离方法的选择依据：
茨维特tsweet1906碳酸钙石油醚连续色带色层或色谱色谱法得名纸色谱薄层色谱气相色谱高效液相色谱离子色谱凝胶色谱亲和色谱植物色1概念色谱法是一种物理的分离方法利用不同物质在两相中具有不同的分配系数并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法
第七章 色谱分离技术
产生的必然性
随着科学的进步，某些关系到人们生命安全 的生物药品，尤其是注射药品和生物工程产品 等，都需要高度纯化。但是，经典的分离方法 （如萃取、结晶等）很难满足需要。
2.吸附的类型：
物理吸附 化学吸附 交换吸附
物理吸附
化学吸附
产生方式 分子力（范德华力） 库仑力(电子转移，生成化学键)
活化能
低
高
进行温度
低温
高温
释放热量
小
很大
速度 选择性
较快，容易达到平衡 不严格
慢，平衡慢 强
交换吸附： 吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会 吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时 放出等物质的量的离子，发生离子交换。
2.配基的选择 ① 特殊配基
抗原的抗体，酶的专一抑制剂，激素的受体 ② 通用配基
可适于一类物质的分离提纯
3.载体的活化与偶联 载体具有惰性 先活化再与配基偶联 活化的作用：
载体表面活化后产生的活性基团可在简单的化学条件 下与配基上的氨基、羧基、羟基或醛基等发生共价结合
（三）影响吸附亲和力的因素
配基浓度：高 空间障碍：在载体与配基之间插入多烃链“手臂” 配基与载体的结合位点 载体孔径
二、吸附色谱法
依靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异 而分离的方法。
吸附剂是一些多孔性物质，表面布满许多吸 附位点，即活性中心。吸附色谱过程就是样品 中各组分的分子与流动相分子不断争夺吸附剂 活性中心并不断达到平衡的过程。
被吸附的物质称为吸附物。
吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢 键或化学键。
（2）基本特点：
① 分离效率高。其效率是所有分离纯化技术中最高
的，这种高效的分离尤其适于极复杂混合物。
② 应用范围广。（非）极性、（非）离子型、小分
子和大分子、无机和有机及生物活性物质、热（不）稳 定化合物；尤其是对生物大分子的分离，其他方法无法 取代。
③ 选择性强。可变参数很多：不同的色谱分离方法、
离子交换树脂 组成 活性离子
离子交换色谱法的固定相应该是什么？
离子交换色谱法：利用离子交换树脂作为固定 相，以适宜的溶剂作为流动相，使溶质按它们的 离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。
利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测 定溶液中阳离子和阴离子的一种分离方法。
基本原理：
带电物质因电荷力作用而在固定相和流动相之 间分配得以相互分离。
孔隙度通过改变琼脂糖浓度而达到（与葡聚糖不同） （联系琼脂糖凝胶电泳）
化学稳定性：琼脂糖凝胶 < 葡聚糖凝胶 没有干胶，必须在溶胀状态保存。
能分离几万至几千万高相对分子质量的物质， 分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随 浓度上升而提高。
适用于核酸、多糖和蛋白质类物质的分离。
3. 聚丙烯酰胺凝胶
五、凝胶色谱法
凝胶色谱法：以凝胶为固定相、基于分子大 小不同而进行分离的一种方法。因其整个过程 和过滤相似，又称凝胶过滤、分子筛过滤等。
凝胶：一种不带电荷的具有三维空间的多孔 网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构 就如一个筛子。
（一）原理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体， 当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径 大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便 随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直 径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶 珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不 同从而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分 子物质后被洗脱下来。