高效液相色谱简介及操作

四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
? 防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤）Leabharlann Baidu
? 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。
? 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。
分析未知物质------联用技术
? 色谱-质谱联用 ? 色谱-核磁共振联用 ? 色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用
二、高效液相色谱仪的结构
液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以 及检测和记录系统四大部分组成。此外，可根据需要配 置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统 、柱后反应系统和全自动控制系统等。
高效液相色谱仪就这样诞生了
LC
GC
HPLC
2.为什么叫高效液相色谱???
使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相，分离效率大大提 高。
填料颗粒小（2~10μm），受到的阻力较大，为了能迅速地通过 色谱柱，必须对载液施加15~30MPa的高压。
由于采用高压，载液在色谱柱内的流速可达l~10mL／min，因而 所需分析时间少。
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
? 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值
? 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
5.如何评价色谱峰？？
? 柱效：描述被分离组分的集中程度。 柱效越高， 组分越集中，对应色谱峰的 峰宽越窄。可用理论 塔板高度 H描述。H越小，柱效越高。
a. 紫外检测器(UVD)：应用最广泛的检测器。
原理：朗伯-比尔定律
特点：使用面广； 灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）； 线性范围宽； 对温度和流速变化不敏感； 可检测梯度溶液洗脱的样品。
缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长 应小于检测波长。
b. 示差折光检测器 (RID)
凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示 差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使 用此检测系统。
H? L n
? 选择性：描述不同组分的分离程度。 选择性越高 两个色谱峰顶相距越远 。用R表示
（a）柱效和分离度都不好；（b）分离度高，柱效低；（c）理想色谱峰
? 用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能
R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时， 分离程度可达98%，R<1.0时两峰有部分重叠， R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用 R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.
高效液相色谱
High-Performance Liquid Chromatography
，
HPLC
主要内容
1 高效液相色谱概述及原理 2 高效液相色谱仪的结构 3 基本操作步骤
4 主要注意事项
一、高效液相色谱概述及原理
? 高效液相色谱法（ HPLC）是在20世纪70年代在 经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来 的一种高效、快速的分离分析技术。
原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差 来测量试样浓度。
特点： 通用性检测器； 对温度变化比较敏感，要保持在±0.001℃； 灵敏度低(10-6g)； 对溶剂变化敏感，不适用于梯度洗脱。
c. 荧光检测器 (FLD)
只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
适用范围： 适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类， 高级脂肪酸，磷脂， 维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。
5 数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和 处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确 开展。
三、高效液相色谱基本操作步骤
（1）检查电源线连接是否正确后打开电源开关
原理: 某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性 质检测。 特点: 选择性检测器，灵敏度比紫外检测器高2-3个数 量级，可达到 10-12g；选择性好，对流量和温度敏感性低。 缺点：只适合于能产生荧光的物质的检测。
d. 蒸发光散射检测器(ELSD)
工作原理: 通过检测光散射程度而测定溶质
浓度的检测器。
采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器， 检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01n g；荧光和电化 学检测器可达0.1pg。
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
? 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
（2） 高压输液泵
?主要部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果 的可靠性，常用的压力范围：(150～350)×105 Pa。
? 输液泵应具备如下性能：
①流量稳定； ②流量范围宽； ③输出压力高； ④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。
高压泵的分类
分类
恒压泵 恒流泵
螺旋注射泵 柱塞往复泵 隔膜往复泵
（2）泵体及流路内的气泡排除
（3）正确连接色谱柱 注意流向标志，切勿反接
（4）系统平衡
? 第一步：先用甲醇或乙腈冲洗流路约 20分钟，平衡活化色 谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。
? 第二步：平衡色谱柱 方法一：若流动相为有机相与水相的混合物，则第一
步完成后，按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例 后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。
方法二：若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸， 则第一步完成后，先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟 后，再按照分析样品的需要调节流动相的比例，冲洗流路 约30分钟，待基线走平后即可进样。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
? 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。
? 要注意流动相的脱气。 ? 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 ? 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建
议不超过两天，最好每天更换。
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往复式柱塞泵
2 进样系统
? 进样方式：注射器进样、阀进样、自动进样。 ? 早期使用注射器进样，现在大都使用耐高压的六通阀进
样或自动进样。
六通阀的结构：
3 分离系统
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱
是高效液相色谱的心脏。
? 柱管多用不锈钢制成。 ? 两端的柱接头内装有筛板，防止填料漏出。 ? 填料的粒度多为0.2-20 μm(5-10μm) 。
1.色谱的演化
? 色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同， 在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间 长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先 后流出。
经典的柱色谱
? 渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱
经典的柱色谱
气相色谱示意图
? 高效液相色谱 ：效仿气相色谱，用高压输液泵将
流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动 ，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液 相色谱就这样诞生了。
? 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 ? 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量
的稳定性和分析结果。
2 色谱柱使用的注意事项
? 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 ? 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般
为甲醇）。 ? 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
? 常规分析柱：内径2~5mm(常用4.6mm，3.9mm)， 柱长10~30cm (15cm，25cm居多）。
4 检测系统
主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由 工作站记录数据，定性、定量分析。
高效液相色谱常用的检 测器有紫外检测器、示 差折光检测器和荧光检 测器等。
高效液相色谱仪结构流程图
1 高压输液系统
高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成，核心 部件是高压泵。
（1） 贮液器
? 流动相贮液器，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成，常用 体积为0.5~2L。
? 流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。
常用脱气方法：超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。