花粉生活力测定

实验九花粉生活力测定
一、实验目的
1．学习和了解植物花粉生活力测定方法及原理。

2．初步掌握稻、麦的花粉生活力测定方法。

二、内容说明
农业常规育种工作中，为了进行人工辅助授粉和杂交授粉，尤其是杂交育种工作，为解决亲本花期不一致和远距离杂交的问题，通常需要早期采集和储藏花粉。

不同类群植物花粉在自然条件下的寿命，花粉的储藏条件，以及花粉生活力的测定有所区别，这一是由花粉本身的特征决定的，二是由贮藏条件决定的。

一般来说，禾谷类作物花粉的寿命较短，自花授粉植物花粉的寿命尤其短，如小麦在花药开裂后30min，花粉即由鲜黄色变为深黄色，此时己有大量花粉丧失活力。

在许多特殊条件下，花粉生活力的差异对于研究花粉-柱头的相互作用，作物改良与育种操作，基因库的保持，不亲和性与受精关系，生理调节对花粉萌发的影响和基因流等，均有非常重要的实践意义。

因此，对于外地采集来的花粉的短暂贮藏、花粉的生物学研究、自交或远缘杂交分析结实率或不结实原因、鉴定雄性不育系时，花粉生活力的测定显得很重要。

花粉生活力有很多表述法，为了方便起见，现将各种表述方法列表如下(表9-1)，以供参考。

表9-1 花粉生活力的各种表述法
花粉生活力的测定方法较多，通常可分为萌发测定和不萌发测定两大类，常用的有：（1）形态鉴定法是一种简便的鉴定新采集花粉的方法。

可通过直接观察花粉在形态上有明显差异来鉴定花粉有无生活力。

发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。

而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。

因
内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易涨而破裂。

一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。

（2）染色鉴定法（FCR法）用不同的化学试剂如双乙酸荧光素(fluorescein diacetate)、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。

双乙酸荧光素是一种荧光染料，其本身不产生荧光，无极性，可以自由地透过完整的原生质膜。

当此种染料进入原生质后，即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素，并且这种物质不能自由出入原生质膜，而只在细胞内积累，所以，可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。

此方法可同时反映出酶活和质膜情况两个指标。

（3）花粉发芽测定法配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验。

根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。

也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。

三、材料仪器药品
1．材料当天采集的稻、麦任一种作物的新鲜花粉。

2．仪器用具冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。

3．药品KNO3、NaOH、MgSO4、MnSO4、Ca(N03)2、H3BO3、1%I-IK溶液、双乙酸荧光素、丙酮、乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯淀粉、蒸馏水。

四、方法步骤
花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序观察鉴定：外形观察→I-IK测定内含物的充实度→染色法鉴定花粉酶学性质→花粉发芽试验→观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。

（一）形态鉴定
1．将少量正常的稻、麦的新鲜花粉用解剖针播于一般载玻片上，于低倍显微镜下观察花粉形态。

根据形态特征，判断花粉的生活力状况。

一般来说，畸形、皱缩、小型化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。

将观察的结果统计一下填写表格9-2。

2．与形态观察相同。

但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I-IK，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。

正常花粉应有较多的淀粉粒，遇I-IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。

（二）FCR测定法（荧光染料反应法)
荧光染色法可根据细胞质膜完整性判断花粉的生活力。

迅速简便，与萌发测定有相
关性，对亲本与F1代的鉴别非常有效。

由于花粉细胞质膜的完整性不同，经过荧光素双乙酸反应，活细胞发出绿色荧光，死细胞无荧光，可统计花粉细胞存活率((FCR值)。

1．试剂配制
（1）母液1(SSl)的配制称取1.75 mol/L蔗糖，3.32 mmol/L H3BO3，3.05 mmol/L Ca(N03)2，3.33 mmol/L MgSO4，1.98 mmol/L KNO3，然后蒸馏水定容。

为了避免由渗透压引起的花粉管破裂，可以增加蔗糖浓度，若想得到更强的荧光反应还可加大盐的浓度。

（2）母液2（SS2）的配制7.21 mmol/L双乙酸荧光素溶于丙酮中，放于4℃冰箱保存。

（3）工作液取8~12滴SS2于10 ml SS1中，混匀直到此混合液变为轻乳状。

2．染色取已成熟尚未开花的水稻或小麦花粉5~10个，切断花药两端，放入小烧杯中，加FCR工作液，使花药完全浸入反应液中
3．压片镜检取出花药，置于载玻片上，用解剖针压出花粉，去掉花药药壁组织，盖上盖玻片，2 min后在荧光显微镜镜检观察，取5个视野，统计荧光花粉百分率。

将观察的结果统计一下填写表格9-2。

（三）花粉发芽鉴定
1．配制培养基
⑴水稻称取马铃薯淀粉6 g、蔗糖20g、H3BO3 0.01g，加100ml蒸馏水，煮沸呈糊状，然后置温箱内保温保湿，备用。

⑵小麦称取蔗糖10g、琼脂3.5 g 、H3BO3 0.02g，加100ml蒸馏水，加热熔化后置温箱内保温保湿，备用。

以上培养基pH5.2~6.0。

2．置床发芽
将配制好的培养基，乘未凝结时均匀地在载玻片上涂一薄层，制成发芽床，置室温（27~29℃）下5min后，用毛笔蘸取刚开花的花粉，轻轻地将花粉弹落在床上，密度要稀而均匀，使花粉发芽力保持正常均一，也便于观察统计。

3．镜检观察
花粉置发芽床后，把载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，加盖。

水稻在27~29℃下保温保湿5min；小麦于22~26℃下1~2h；然后镜检观察。

凡花粉管伸长超过花粉粒直径的即为发芽的花粉。

统计花粉发芽率填写表格9-2。

（四）花粉萌发观察
花粉萌发率是衡量花粉生活力状况的主要标志，同时花粉管长度亦在一定程度上反
映花粉的生活力状况。

一般根据花粉在柱头上的萌发率判断其生活力。

1．棉蓝染色法取授粉后一定时间（水稻授粉后10~3 min、小麦授粉后2~4h）的整个雌蕊，放在载玻片上，滴几滴棉蓝溶液（按乳酸：苯酚：甘油：蒸馏水：棉蓝为25：25：25：25：0.8配制），盖上盖玻片。

在盖玻片上一侧滴入40%甘油，在另一侧用滤纸将染料吸去。

如此重复进行，直至盖玻片下部为甘油所浸透，然后置显微镜下观察，花粉管为蓝色，而柱头组织无色或淡蓝色。

注意染色时间不宜过长。

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2．荧光显微镜观察
⑴固定取水稻开花授粉后10~15min、小麦2~4h的整个雌蕊，用卡诺固定液固定，2h后移入70%酒精中保存，备用。

⑵软化制片前，水稻、小麦的材料用8 mol/L NaOH软化10min（煮沸）。

然后水洗去碱。

⑶镜检将染色的材料置于载玻片上，盖上盖玻片，压片后置荧光显微镜下观察。

以BG12为激发光源(蓝紫光)和0515为激光滤片。

在此光源下，花粉粒呈暗红色，花粉管呈淡黄色荧光，组织背景黑色。

五、实验作业
1．测定花粉生活力的意义有哪些?
2．观察荧光显微制片，比较不同作物花粉管伸长情况。

3．用不同的方法测定花粉生活力，填写表9-2，并对测定结果做出分析比较。

表9-2。