基于正交试验法优选制何首乌提取工艺

临床探索
基于正交试验法优选制何首乌提取工艺
李帅锋 （苏州大学附属儿童医院，江苏苏州 215003）
摘要：目的：优选制何首乌提取工艺。

方法：通过高效液相色谱法，以二苯乙烯苷、游离蒽醌为指标，优选制何首乌提取溶剂。

采用L9（3）4正交试验，进一步对其醇提工艺进行优化，确定制何首乌的最佳提取工艺。

结果：乙醇为制何首乌的最佳提取溶剂，最佳提取工艺为：10倍量60%乙醇加热回流3次，每次1.5 h。

结论：制首乌的提取工艺较为合理，稳定可行。

关键词：正交试验；二苯乙烯苷；游离蒽醌；提取工艺
何首乌为蓼科植物何首乌（PolygonummultiflorumThunb）的干燥块根，制何首乌为何首乌的炮制加工品，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊脂的作用[1]。

制何首乌作为传统的补益类中药，在临床应用广泛。

《中国药典》2020版一部更是收录了包括人参首乌胶囊、乙肝养阴活血颗粒等多种包含制何首乌的中成药。

现代研究表明，何首乌中二苯乙烯苷、蒽醌类具有保护神经、改善记忆、保肝、消炎、抗菌等作用[2]。

目前对何首乌的研究多集中在药材采收期、产地及饮片的炮制、质量变准、药理活性等方面，鲜有对其提取工艺的研究[3]。

本研究以二苯乙烯苷、游离蒽醌为指标，通过考察提取溶剂、提取方法，确定制何首乌的最佳提取工艺，以期为制何首乌的开发提供依据。

现报道如下：
1仪器与材料
1.1仪器
Waters 2695高效液相色谱仪（waters 2996检测器），Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），AY220型电子天平（精确度为万分之一），sartotius. BP211D型电子天平（精确度为十万分之一），Anke TGL-16B离心机，南京金正教学仪器有限公司RE-201D旋转蒸发器，DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱，江苏国胜实验仪器厂HH-S恒温水浴锅。

1.2试药
大黄素甲醚、大黄素、二苯乙烯苷，购自瑞芬思生物技术有限公司（批号：D-004-130315、D-029-130401、F-022-130512）。

制何首乌饮片由贵州昌昊有限公司提供，产地贵州省从江县，经吴启南鉴定鉴定为蓼科植物何首乌Polygonummultiflorum Thunb的炮制品。

甲醇与乙腈均为色谱纯，水为超纯水（实验室自制），乙醇（分析纯）。

2方法与结果
2.1色谱条件与对照品的制备
色谱条件：固定相为A g i l e n t C18色谱柱（4.6 m m×250 mm，5 μm），二苯乙烯苷：以乙腈-水（25∶75）为流动相；检测波长为320 nm。

游离蒽醌：以甲醇-0.1％磷酸溶液（80∶20）为流动相；检测波长为254 nm[1]。

柱温均为25℃，流速：1 ml/min。

对照品溶液的制备：取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含0.199 mg的溶液，即得。

取大黄素对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成大黄素3.98 mg/100 ml、大黄素甲醚2.18 mg/100ml的溶液。

依照上述色谱条件，按照要求对对照品进行稀释，各进样10 μl，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的回归方程分别为Y=2.9×107X-97302，r=0.9998；Y=3.2×107X-13422，r=0.9999；Y=2.9×107X-4541.3，r=0.9999。

2.2制首乌提取溶剂优选
2.2.1 样品的制备
取制何首乌饮片粗粉约8 g，分别加10倍量95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水浸泡0.5 h，加热回流3次，每次回流1.5 h，滤过，合并滤液，95%乙醇定容到500 ml，分别取200 ml减压回收乙醇并浓缩。

浓缩液置蒸发皿中，挥干溶剂，得到2份样品。

2.2.2 样品的测定
分别取不同提取方式得到的样品，一份置100 ml 容量瓶中，取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于测定二苯乙烯苷含量。

取另一份置100 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作为供试品溶液，测定游离蒽醌[3]。

依照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录各指标成分的含量。

结果见表
1。

由上表可见，以二苯乙烯苷为指标，4种提取方式的样品含量依次为：50%醇＞70%醇＞水＞95%醇。

以游离蒽醌为指标，4种提取方式样品的含量依次为：
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70%醇＞50%醇＞95%醇＞水，确定乙醇为制何首乌的提取溶剂。

2.3制何首乌提取工艺优选
根据提取溶剂优选结果及前期实验结果，通过正交试验法，考察溶剂量、提取次数、乙醇浓度3个因素对制何首乌提取的影响，从而确定最佳的提取工艺。

2.3.1 样品的制备
取制首乌4 g，用所选溶剂浸泡0.5 h，按正交试验设计方案进行试验，依照制首乌提取溶剂优选中制备方法进行制备，最后得到2份样品。

2.3.2 样品溶液制备
取样品，一份置50 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容。

取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于测定二苯乙烯苷含量。

取另一份置50 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作为供试品溶液。

2.3.3 测定法
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，运用回归方程计算含量。

2.3.4 正交试验及结果
分别取4 g制何首乌粉末，根据2.3.1的步骤，对样品进行处理，进行9组试验，实验结果及方差分析见表
2~3。

由表2直观分析可知：K A3＞K A2＞K A1，K B3＞K B2
＞K B1，K C2＞K C3＞K C1，极差结果显示因素影响性为B
＞C＞A，故A3B3C2组合提取效果较好，即用10倍量60%乙醇回流3次。

由表3方差分析可知3个因素均无显著性差异。

综合以上结果，在实验结果的基础上，结合实际的生
产情况，确定A2B3C2为最终工艺，即用10倍量60%
乙醇回流3次。

在保证疗效的同时，降低生产成本。

2.4工艺验证
称取4 g制首乌按照A2B3C2组合工艺条件进行加
热回流，每组试验样品平行3份，依法测定。

结果见表
4。

工艺验证结果表明：A2B3C2组合中二苯乙烯苷、
游离蒽醌的含量与正交工艺中的含量相当，差异较小。

且A2B3C2组合工艺的RSD较小，工艺较为稳定。

同
时缩短生产周期，大大提高了经济效益，因此加热回
流最佳工艺为10倍量60%乙醇回流3次。

3讨论
本实验首先通过HPLC法，以二苯乙烯苷、游离
蒽醌为指标考察了不同提取溶剂对制何首乌的提取效果。

通过查阅文献研究发现，提取溶剂、提取次数、
溶剂量对饮片提取效果影响较为明显，故本研究选取
上述3个因素，优选制何首乌的提取工艺。

通过预实验，分别确定了3个因素的水平。

本实验采用加权综合评分法，对实验结果进行综
合评分。

文献研究表明，何首乌中主要的活性成分为
二苯乙烯苷、蒽醌类化合物，其中二苯乙烯苷更是表
现出多种生物活性，与制何首乌的补益作用更为相符[8]。

实验结果显示，二苯乙烯苷在60%乙醇条件下
提取率较高，蒽醌在70%乙醇中提取率较高，提取结
果与化学成分性质相符合A因素K3＞K2＞K1，其
余两个因素K2最大，结果表明因素水平设计的合理性；极差结果显示提取次数对提取效果的影响最大，
乙醇浓度次之，其与方差分析结果一致。

参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京:
中国医药科技出版社,2020:184.
[2] 李帅锋,郑传柱,张丽,等.不同产地何首乌药材的质量分析[J].江苏中医药,2015,47(8):69-71.
[3] 杨建波,高慧宇,王雪婷,等.何首乌中1个新的木脂素酰胺
类化合物[J].中草药,2021,52(18):5475-5482.
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