酶工程课后题答案.doc

第一章
1.简述酶与一般催化剂的共性以及作为生物催化剂的特点
共同点：只能催化热力学所允许的的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点：反应前后酶本身没有质和量的改变：很少量就能发挥较大的催化作用：其作用机理都在于降低了反应的活化能。

酶作为生物催化剂的特点：1.极高的催化率；2.高度专一性；3.酶活的可调节性；酶的不稳定性。

5.酶失活的因素和机理。

酶失活的因素主要包括物理因素，化学因素和生物因素
物理因素
1热失活：热失活是由于热伸展作用使酶的反应基团和疏水区域暴露，促使蛋白质聚合。

2冷冻和脱水：很多变构酶在温度降低是会产生构象变化。

在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变，很容易引起蛋白质的酸变性。

3.辐射作用：电离辐射和非电离辐射都会导致多肽链的断裂和酶活性丧失。

4.机械力作用：
化学因素
1.极端pH：极端pH远离蛋白质的等电点，酶蛋白相同电荷间的静电斥力会导致蛋白肽链伸展，埋藏在酶蛋白内部非电离残基发生电离，启动改变。

交联或破坏氨基酸的化学反应，结果引起不可逆失活。

极端pH也容易导致蛋白质水解。

2.氧化作用：酶分子中所含的带芳香族侧链的氨基酸以及Met, Cys等，与活性氧有极高的反应性，极易受到氧化攻击。

3.聚合作用：加热或高浓度电介质课破坏蛋白质胶体溶液的稳定性，促使蛋白质结构发生改变，分子间聚合并沉淀。

4.表面活性剂和变性剂：表面活性剂主要改变酶分子正常的折叠，暴露酶分子疏水内核的疏水基团，使之变性；变性剂与酶分子结合，改变其稳定性，使之发生变性。

生物因素
微生物或蛋白水解酶的作用使酶分子被水解。

6.简述酶活力测定方法的原理
直接测定法：有些酶促反应进行一段时间后，酶底物或产物的变量可直接检测。

间接测定法：有些酶促反应的底物或产物不易直接检测，一次必须与特定的化学试剂反应，形成稳定的可检测物。

酶偶联测定法：与间接测定法相类似，只是使用一指示酶，使第一酶的产物在指示酶的作用下转变成可测定的新产物。

第二章
1.在酶制剂工业生产中为什么以微生物发酵生产为主？
应用微生物来开发酶有下列优点：1.微生物生长繁殖快，生活周期短。

2.微生物种类繁多。

3.当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。

2.影响酶制剂发酵的因子有哪些？
培养基的成分，发酵条件，发酵方法。

3，酶制剂发酵生产的方法有哪些？各有何优势？
固体培养法：（转桶法，厚层通气法）。

优点：1.单位体积培养设备中的产酶量高；2节省动力；3由污染引起的问题少，易于管理；4.酶抽提液的浓度可任意调节；5.后处理设备小。

液体深层培养法。

优点：设备占地面积小、生产可以机械化，自动化。

4.如何提高酶的产量？
1.添加产酶促进剂；
2.菌种诱变；（生产组成型酶突变株的筛选，抗分解代谢阻遏突变株的
选育，抗反馈阻抑突变株的筛选）。

第三章
2从植物细胞培养产酶的特点分析，为什么与植物体产酶比植物细胞产酶更有优势？
1.次生物质的生产是在可控制的条件下进行的，因此可以通过改变培养条件和筛选细胞
系来提高次生代谢产物的产率
2.培养细胞是在无菌条件下进行的，因此可以排除病菌和虫害的影响，以及环境中的有
害物质污染，从而提高产品质量。

3.植物细胞的倍增时间一般为12~60h，发酵周期为10~30d，与植物生长周期相比，大
大缩短了生产周期。

4.可以进行特定的生化转化反应和探索新的合成路线，以获得新的有用物质。

3用于产酶的植物细胞的来源有哪些？
1直接从外植体中分离得到；2通过诱导愈伤组织而获得；3分离原生质体后再经过细胞壁再生而获取所需的植物细胞。

4动物细胞培养前都需要做哪些准备工作？
1基质的准备
2 培养环境的准备【营养物质，细胞的生产环境（温度，气相，pH，渗透压）】
3 细胞的准备（原代细胞培养，传代细胞培养）
5根据细胞在培养基中的位置不同，动物细胞的培养方式有哪些？
1 贴壁培养，
2 悬浮培养，
3 微载体培养系统，
4 包埋培养，
5 微囊化培养。

第四章现代分子技术产酶
1 什么是克隆酶？试述克隆酶生产的基本过程。

克隆酶：利用DNA重组技术而大量生产的酶，称克隆酶。

克隆酶生产的基本过程：1 目的基因的获得；2 载体的选择；3 目的基因与载体分子的连接（黏性末端，平末端的连接）；4 重组DNA的转化；5 克隆酶基因的表达（原核生物，真核生物的表达系统）
2 什么是基因的定点诱变技术？目前已建立的定点诱变方法主要有哪些？
定点诱变技术：通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基，从而实现心中体外特异性改变某个基因，这种技术称为定点突变技术。

已建立的定点诱变方法主要有盒式诱变、寡核苷酸引物诱变、PCR诱变
3 什么是抗体酶？抗体酶的制备的方法主要有哪些？
抗体酶：抗体酶是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。

抗体酶的制备方法：拷贝法；引入法；诱导法；抗体库法。

4 简述进化酶、核酸酶、杂合酶、超自然的酶—新酶，人工合成全酶、人工半合成酶以及
印迹酶的概念及研究进展。

进化酶：在体外模拟自然进化过程（随机突变、基因重组、定向选择或筛选），使基因发生多种变异，最后定向选择或筛选出所需性质或功能的酶，该策略称为酶分子的非
合理设计。

把通过此方法得到的酶称为进化酶。

核酸酶：具有生物催化功能的核酸分子（RNA,DNA）。

杂合酶：把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，可以产生具有所需性质的优化酶杂合体。

把通过这种途径产生的酶称为杂合
酶。

新酶：至用蛋白质工程技术设计新的酶的结构基因，进而生产自然界从未有过的性能稳定、活性高的酶。

人工全合成酶：这类人工酶不是蛋白质，而是有机化合物，通过并入酶的催化基团来控制空间的构象，像自然酶那样能选择性地催化化学反应。

人工半合成酶：以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构，从而形成一种新的人工酶。

印迹酶：指通过分子印迹技术产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合与催化作用的人工模拟酶。

第五章酶的分离纯化
1简述酶分离纯化方法及工艺程序的选择策略。

（1）先选用非特异的、低分辨的技术，去除主要的杂质并使酶溶液浓缩；如沉淀、超滤和吸附等。

（2）随后采用高效分离的手段；如离子交换层析、亲和层析。

（3）将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。

如凝胶过滤层析。

2如何对酶分离纯化方法及工艺程序的优劣进行评价？
一个完整的酶制备方案包括酶测定方法的建立、材料的选择、预处理对酶性质
的初步探索、制定酶的纯化程序、酶成品的保存。

评价分离纯化方法及工艺程序优劣的指标：
1总活力的回收率
2纯化倍数：比活力提高的倍数
因此在酶的分离纯化过程中必需测定每一步的酶液体积（mL）、蛋白含量
（mg/mL）、酶活（U/mL).
3破碎细胞有哪些方法？试述它们的优，缺点及适用对象。

（一）机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。

1.捣碎法
利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织破碎。

适用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织及微生物，特别是细菌的破碎。

在实验室和规模生产均可采用。

2.研磨法
利用研磨产生的剪切力将细胞破碎。

此法适用于微生物和植物组织细胞的破碎。

研钵、细菌磨用于实验室使用，石磨、球磨用于工业化生产。

研磨法设备简单，但效率较低
3.匀浆法
利用匀浆器、高压匀浆机产生的剪切力将组织破碎。

通常用来破碎那些易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。

非常适合细菌、真菌的破碎。

适用于实验室，但难于在工业生产上应用。

此法破碎程度高，对酶的破坏较少。

（二）温度差破碎法
通过温度的突然变化使细胞破碎。

该方法对那些较为脆弱、易于破碎的细胞有较好
的破碎效果。

此法适用于实验室，但难于工业化生产。

不能在过高温度下操作，以免引起酶的变性失活。

该法简单易行，但效率不高，常需反复几次才能达到预期目标。

（三）压力差破碎法：
通过压力的突然变化使细胞破碎。

1.高压冲击法
在容器中再装入细胞和冰晶、石英砂，用活塞或冲击锤施以高压冲击，从而使细胞破碎。

2.突然降压法
将细胞悬浮液装进高压容器中，加压至30MPa以上，打开出口阀门，使细胞悬浮液经阀门迅速流出。

从而使细胞迅速膨胀而破碎。

也可采用N2或CO2加压到5~50MPa，然后突然排除气体，压力骤减，使细胞破碎。

3.渗透压差法
利用渗透压的变化使细胞破碎。

不适用于具有坚韧的多糖细胞壁的细胞。

（四）超声波破碎法
在高于20kHz的超声波的作用下，使细胞膜产生空穴作用而使细胞破碎。

该法适用于微生物细胞的破碎。

该法适用于实验室使用，具有简便、快捷、效果好等优点。

此方法的主要问题是会引起局部过热而使酶活性丧失。

所以处理时间应尽量短，或在容器周围加冰浴处理。

（五）化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而使细胞破碎。

常用的化学实际有：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂；还有非离子型的Triton、吐温等表面活性剂。

表面活性剂处理适用于膜蛋白的提取。

六）酶促破碎法
通过外加酶或细胞本身存在酶的催化作用，使细胞破碎。

应根据细胞外层的特点，选用适当的酶。

革兰氏阳性细菌：溶菌酶；
革兰氏阴性细菌：溶菌酶+EDTA
霉菌：几丁质酶；
酵母：蛋白酶+β-1，3-葡聚糖酶
植物细胞：纤维素酶+半纤维素酶+果胶酶
由于上述酶价格较高，所以不适于规模化的工业生产。

所以可将细胞在一定的pH和温度下保温，通过细胞本身的酶系将细胞破坏，使胞内物质释放，此方法称为自溶法。

4简述影响酶提取的主要因素及影响规律。

（1）抽提溶质的性质（酸性酶宜用碱性溶剂抽提，碱性酶宜用酸性溶液抽提，极性大的酶宜用极性溶剂抽提，含有较多非极性基团的酶宜用有机溶剂抽提。

）。

（2）抽提溶剂的用量（增加用量可以提高酶的提取率。

但是过量的抽提溶剂，会使酶的浓度降低，对酶的进一步分离纯化不利。

用量一般为原料体积的3~5倍，最好分
次抽提）
（3）温度（提取时温度对酶的提前效果有明显影响。

一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，增大酶分子的扩散速度。

但温度过高易引起酶变性失活，所以提
取温度不宜过高。

要根据被抽提酶的酶学性质选择适宜温度）
（4）pH 对酶的溶解度和稳定性有显著影响。

（为了提高酶的溶解度，提取酶时应该远离酶的等电点，但是溶液pH值不宜过高或过低，否则容易引起酶变性失活。

（5）其他因素（在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒越小，则扩散面积越大，越有利于提高酶想溶液中扩散的速度。

适当的搅拌有利于提高扩散速度。

适当延长提取时
间，可以使更多的酶溶解出来，从而提高酶的提取效果）
5简述粗酶液净化、脱色及浓缩的原理与方法。

粗酶液的净化与脱色
a. 细胞、细胞碎片离心、过滤
b. 核酸核酸酶或鱼精蛋白
c. 黏多糖乙醇、单宁酸、离子表面活性剂
d. 黏度过大加絮凝剂处理
（2）粗酶液的脱色
a. 活性炭0.1%-1.5%
b. 离子交换树脂Duolite S-30、通用1号
粗酶液的浓缩
（1）沉淀法
用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，在将沉淀容分解在小体积溶液中。

（2）超滤法
利用不同的超滤膜来浓缩，此方法简便、迅速、温和、处理样品量可达可小。

（3）凝胶吸水法
向蛋白质溶液中加入固体Sephadex-25等吸水剂。

蛋白质收率较低。

（4）离子交换法
吸附到离子交换剂上，然后用少量盐溶液洗脱下来。

（5）透析法
将聚乙二醇（PEG）涂于装有蛋白质溶液的透析袋上，置于4ºC。

为防止PEG进入蛋白质溶液，最好用分子量大的PEG（如PEG20000）。

（6）真空浓缩
（7）冷冻浓缩
（8）蒸发浓缩
6比较各种沉淀分离方法的优、缺点，并说明是适用于实验室研究还是适用于规模化的酶的提纯。

常用的沉淀分离方法为：
盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、复合沉淀法
选择性沉淀法、变性沉淀法
盐析法
优点：安全、操作简便、使用范围广泛、重复性好、费用低等。

缺点：分辨率低、纯化倍数较小（一般可使纯度提高约5倍）、硫酸铵易腐蚀离心机、固液较难分离、常需要脱盐
因此，该方法不适用于大规模纯化。

有机溶剂沉淀法
优点：分辨率高；析出的酶沉淀一般易于离心或过滤分离，且无需脱盐处理；
有机溶剂易被除去或回收。

缺点：有机溶剂易燃；有机溶剂易引起酶变性失活。

因此，该方法不适用于规模化的酶的提纯。

等电点沉淀法
优点：操作简单
缺点：分级效果和回收率均不理想
此方法只用在粗分离阶段
7简述各种层析分离方法的原理。

层析分离: 亦称色谱分离，是利用混合物中各组分的物理化学性质及生物学特性的不同，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而使不同的组分分离。

8酶溶液浓缩的方法有哪些？简述这些方法的原理。

方法：沉淀法，透析法，超滤法，离心法，离子交换吸附法，凝胶吸附法，用各种吸水剂吸去水分也能达到浓缩效果。

这里主要介绍蒸发浓缩。

蒸发缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。

由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。

第六章酶分子的化学修饰
1 什么是酶分子的化学修饰？有何作用？
酶分子的化学修饰：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。

作用：通过修饰可以使酶分子结构发生某些变化，提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或是消除酶的抗原性等。

2 举例说明酶主链切断修饰。

利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。

酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。

胃蛋白酶原—HCL—PH1.5至2-- 胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
3 什么是大分子结合修饰？有何作用？
非共价修饰：使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些大分子添加物，它们通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。

大分子共价修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的活性与功能的方法。

作用：如聚乙二醇、右旋糖苷、多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。

另一类是蛋白质，如常用的BSA。

蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。

4定点突变技术在酶分子修饰中有什么作用？简述其主要技术过程。

作用：通过定点突变技术或是化学方法，将酶蛋白分子中的某个氨基酸残基置换为另一个氨基酸残基，观察其对酶催化反应的影响和变化，分析了解该氨基酸残基在酶催化过程中的作用。

技术过程：A、基因序列分析 B、蛋白质结构分析 C、酶活性中心分析 D、引物设计进行基因定点突变 E、酶基因克隆表达 F、变异特性分析
5简述金属离子置换修饰过程和作用。

a 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。

通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。

此时，酶往往成为无活性状态。

c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。

只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。

用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。

作用：1.阐明金属离子对酶催化作用的影响：
A.显著提高酶活力：如含Mg2+ Zn2+等杂离子α-淀粉酶置换为Ca2+活性提高3倍，而且稳定性也大大增强。

B.稳定性显著增强：如Fe-SOD变为Mn-SOD,提高了对H2O2 、NaN3的稳定性
2.改变酶的动力学特性：酰基化氨基酸水解酶Zn2+置换为Co2+后催化N-氯-乙酰丙氨酸的最适pH从8.5降为7.0，同时对N-氯-乙酰蛋氨酸Km增大
6 酶分子的物理修饰有什么作用？
酶分子的物理修饰：通过修饰分子非共价地与酶分子相互作用来改变酶的应用性能。

第七章固定化酶与固定化细胞
1.什么是固定化酶和固定化细胞？其产生的背景是什么？
固定化酶的概念：是指固定在载体上或被限制在一定的空间范围内，能连续进行催化反应，且反应后能回收并重复利用的酶。

固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。

也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。

背景：为什么要进行酶的固定化？
（1）游离酶的稳定性较差：在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性
失活。

(2)游离酶难于连续化生产：酶与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。

这种一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化生产。

(3)游离酶给下游的纯化工作带来了难度：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。

2.与游离酶相比，固定化酶优缺点各在哪里？
固定化酶优点：
A.容易将固定化酶与底物、产物分开
B.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应
C.在多数情况下，提高了酶的稳定性
D.酶反应过程能够加以严格控制
E.产物中没有酶的残留，简化了提纯工艺
F.比游离酶更适合多酶反应
G.可以增加产物的收率并提高产品质量
H.提高酶的使用效率，降低成本
固定化酶的不足之处：
A.酶在固定化过程中难免造成酶活性的损失
B.增加了载体成本和固定化操作费用
C.固定化酶的扩散阻力会降低反应速度
D.比较适用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适用
E.与完整菌体相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应
3.酶固定化后其性质会发生什么变化？
1.酶结构的改变:固定化导致酶的活性中心或调节中心的构象发生变化。

2.微环境的改变:微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。

3.位阻效应：指载体的遮蔽作用。

4.分配效应：由于载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物或其它效应物在载体和溶液间发生不等分配，改变酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度：A.如果载体与底物带相同电荷，则酶的Km值将因固定化而增大；如果带相反电荷，则Km值减小；B.当载体带正电荷时，酶活性-pH曲线向酸性方向偏移;当载体带负电荷时，酶活性-pH曲线向碱性方向偏移；C.如载体是疏水性，底物为极性物质或电荷物质，则酶的Km值将因固定化而降低。

5.扩散限制效应：是指底物或其它效应物的迁移和运转受到限制。

（1）外扩散限制：指底物或其它效应物从溶液穿过包围在固定化酶周围近于停滞的液膜层到固定化酶表面所受到的限制。

可通过充分搅拌或混合予以减轻或消除。

（2）内扩散限制：指底物或其它效应物从固定化酶颗粒表面进入颗粒内部酶活性位点的限制。

4.固定化方法有哪几类？各类的优缺点及适合范围是什么？
酶固定化的方法很多，主要可分为载体结合法、交联法、包埋法和热处理法等。

现分述如下；
1.载体结合法：根据酶与载体之间相互作用力的不同，有可细分为物理吸附法、离子交换吸附法和共价结合法
1.1物理吸附法：通过氢键、疏水作用力和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上的方法。

优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。

缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到限制。

1.2 离子键交换吸附法：酶通过离子键与含有离子交换基团的水不溶载体相结合的固定化方法。

优点：操作简便，条件温和、酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏、酶活回收率高。

缺点：结合强度受pH值和离子强度等条件影响。

所以用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制好 pH值、离子强度和温度等操作条件。

1.3 共价健结合法：通过酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团之间形成共价键而固定的方法。

对载体的要求：良好的亲水膨润性、结构疏松、表面积大、有一定的机械强度、带有在温和条件下与酶共价结合的功能基团、没有或很少有非专一性吸附。

优点：酶与载体结合牢固，不易脱落，连续使用和操作性能好。

缺点：反应条件比较剧烈，容易导致酶失活，酶回收率在30%左右甚至底物专一性、Km、最适pH等均有变化。

（二）交联法：借助双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。

交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化优点：交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。

缺点：但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。

（三）包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，称为包埋法。

优点：包埋法一般不需要酶分子的基团参与，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。

缺点：化学聚合法反应也比较剧烈，易导致酶的失活；高分子凝胶网格限制了大分子的扩散，因此不适用于涉及大分子底物、产物的酶；聚合强度不高，容易破损。

（四）热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。

热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。

例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60～65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部同定在菌体内。

热处理法也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。