大白菜CHS_基因鉴定及其在高氮水平下转录表达分析雷娟

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㊀㊀2024年第65卷第5期
收稿日期:2023-09-19
基金项目:浙江省自然科学基金(LY19C150009);浙江省农业新品种选育重大科技专项(2021C02065)
作者简介:雷娟利(1971 ),女,陕西西安人,副研究员,博士,研究方向为大白菜甘蓝抗病育种,E-mail:juanlil@㊂
通信作者:李必元(1976 ),男,湖北仙桃人,副研究员,从事大白菜甘蓝育种研究工作,E-mail:16061944@㊂
文献著录格式:雷娟利,赵彦婷,岳智臣,等.大白菜CHS 基因鉴定及其在高氮水平下转录表达分析[J].浙江农业科学,2024,65(5):1102-1107.DOI:
10.16178/j.issn.0528-9017.20230943
大白菜CHS 基因鉴定及其在高氮水平下
转录表达分析
雷娟利,赵彦婷,岳智臣,陶鹏,胡齐赞,李必元∗
(浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州㊀310021)
㊀㊀摘㊀要:为了探究高氮水平引起大白菜叶柄黑点症加剧的机制,通过对抗㊁感叶柄黑点症大白菜品系进行正常氮和高氮水平处理,处理前和处理后不同时间对叶柄取样并进行转录组测序,然后再对大白菜查尔酮合酶(chalcone synthetase,CHS)基因进行鉴定并分析不同的大白菜CHS 基因在正常氮水平和高氮水平㊁抗性品系和
感性品系之间的差异表达,结果表明,共鉴定到7个大白菜CHS 基因,其中有3个(BrCHS 1㊁BrCHS 3及BrCHS 4)在高氮水平下表达量比正常氮水平下高,且在高氮水平下感性品系表达量高于抗性品系㊂因此推测这
3个大白菜CHS 基因可能与大白菜叶柄黑点症的形成有关㊂研究结果为揭示大白菜叶柄黑点症发生机制奠定了基础㊂
关键词:大白菜;叶柄黑点症;查尔酮合酶;高氮;表达分析
中图分类号:S634.1㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2024)05-1102-06
Identification of CHS gene in Chinese cabbage and transcriptional
expression analysis under high nitrogen levels
LEI Juanli,ZHAO Yanting,YUE Zhichen,TAO Peng,HU Qizan,LI Biyuan ∗
(Institute of Vegetables,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,Zhejiang)
㊀㊀Abstract :In order to investigate the mechanism of exacerbation of Chinese cabbage petiole black spot disease caused
by high nitrogen levels,the resistant and suscetible Chinese cabbage were treated with normal and high nitrogen levels,and
sampled petioles were sampled at different time before and after treatment for transcriptome sequencing.The Chinese cabbage chalcone synthase (CHS)gene was identified and analyzed for different Chinese cabbage CHS genes at normal and
high nitrogen levels.The differential expression between resistant and susceptible Chinese cabbage showed that a total of 7
CHS genes were identified,of which 3genes (BrCHS 1,BrCHS 3,and BrCHS 4)had higher expression levels under high
nitrogen levels than the normal nitrogen levels,and the expression level of susceptible Chinese cabbage was higher than that of resistant Chinese cabbage under high nitrogen levels.Therefore,it is speculated that these three Chinese cabbage CHS
genes may be related to the formation of Chinese cabbage petiole black spot disease.This study lays the foundation for revealing the mechanism of black spot disease on the petiole of Chinese cabbage.
Keywords :Chinese
cabbage;
petiole
black
spot
disease;
chalcone
synthetase;
high
nitrogen
level;
expression analysis
㊀㊀植物查尔酮合酶(chalcone synthetase,CHS)
是生物化学与分子生物学领域中的一种酶,属于植物聚酮合成酶超家族,催化3分子丙二酰辅酶A
与1分子香豆酰辅酶A 经脱羧缩合成查耳酮,而查尔酮是类黄酮物质合成途径中的第一个化合物[1]㊂黄酮类物质在植物中具有许多重要的生物
功能,它们参与植物的生长发育[2]㊁花色形成[3]㊁防UV损伤[4]㊁抗病和抗氧化等过程[5]㊂因此,查尔酮合酶对于植物的适应性和产量都有重要影响㊂大白菜叶柄黑点症是由多方面因素共同作用引起的一种生理性病害,对大白菜的商品性造成严重影响㊂不同的大白菜品种对黑点症的感病程度不同,研究人员通过对多份大白菜自交系㊁组合及国内外大白菜品种叶柄黑点症的发生情况调查,发现大白菜叶柄黑点症的发生存在明显的品种间差异,表明叶柄黑点症的发生与基因型有关㊂氮肥过盛是引起叶柄黑点症的重要因素,施用高水平的氮肥量可使叶柄黑点症加剧,即单位面积上的小黑点数量增加[6-8],且氮素营养形态对大白菜叶柄黑点症的发生也会产生影响,研究表明,铵态氮促进大白菜叶柄黑点症发生的作用高于硝态氮和酰胺态氮[9-10]㊂研究结果表明,在高氮处理下,叶柄黑点症感病品系的细胞膜透性㊁SOD活性都显著高于抗病品系,说明ROS诱导细胞死亡直接导致叶柄黑点症的发生[11-12]㊂
由于大白菜叶柄黑点症形成机制方面的研究几乎没有,因此,目前为止引起大白菜叶柄黑点症发生的机制完全不清楚㊂在本研究中,以抗㊁感大白菜叶柄黑点症品系为材料,通过正常氮和高氮水平水培处理,处理前和处理后不同时间取样进行转录组分析,鉴定大白菜CHS基因家族成员,并通过对各成员相对表达水平的比较分析,以期阐明高氮水平下大白菜叶柄黑点症发生与CHS表达的关系,为进一步揭示大白菜叶柄黑点症发生机制奠定基础㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀试验设计
㊀㊀试验于2018年秋季在浙江省农业科学院试验基地桑园温室中进行㊂试验材料为抗㊁感叶柄黑点症大白菜品系韩春娃C8-1(A)和韩春娃-4-2-3-4 (B),采用水培方法进行培养,当幼苗长至四叶一心时进行正常氮水平和高氮水平处理,对照正常氮水平为1ˑ的菜心营养液,处理高氮水平为1ˑ的菜心营养液+10mol㊃L-1NH4NO3[13]㊂处理前和处理后7d及14d分别取样,取样部位为叶柄,每样3次重复㊂取样后液氮迅速冷冻,置于-80ħ冰箱备用㊂
1.2㊀转录组测序
㊀㊀所有30个样品由北京百迈客生物科技有限公司完成转录组测序㊂转录组测序实验流程为RNA 样品检测㊁文库构建(包括mRNA富集㊁反转录㊁末端修复㊁3ᶄ加A及PCR富集)㊁文库质量控制和上机测序㊂不同文库按照目标下机数据量进行
pooling,用Illumina平台进行测序㊂将测序数据进行质量评估,去除接头和低质量数据,然后已完成测序的白菜(Brassicarapa)[14]基因组作为参考基因组进行比对,检测SNP㊁InDel等变异㊂
1.3㊀大白菜CHS基因鉴定
㊀㊀在TAIR()网站查找拟南芥CHS基因及其序列,根据拟南芥CHS基因及其序列在BRAD()网站查找大白菜PAL基因及其序列(参考数据库BRAD V3.0),然后在BRAD网站进行注释查找基于拟南芥对应基因比较㊂
1.4㊀大白菜CHS基因系统树构建
㊀㊀从TAIR和BRAD网站分别下载拟南芥和大白菜CHS基因序列,从NCBI分别下载油菜㊁甘蓝㊁芥菜及萝卜的各一个CHS基因序列,然后用MEGA7.0进行系统树构建㊂首先用ClustalW对拟南芥和大白菜PAL蛋白的氨基酸序列进行比对分析,手动调整使比对结果整齐,采用邻接法(Neighbor-Joining)进行系统发育树构建[15]㊂1.5㊀大白菜PAL基因结构分析
㊀㊀从BRAD网站分别下载大白菜PAL基因的核苷酸序列和CDS序列,然后利用在线软件Gene Structure Display Server(GSDS2.0)绘制基因结构图[16]㊂
1.6㊀大白菜PAL基因的染色体定位分析
㊀㊀从BRAD网站分别获取大白菜PAL基因所在染色体及起始和终止位置信息,然后利用在线软件MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)绘制基因在染色体上的定位分布图[17]㊂
1.7㊀数据分析与处理
㊀㊀大白菜叶柄CHS基因的相对表达数据在百迈客提供的所有基因的表达量(fpkm)矩阵文件(All.DEG.final.xls)中查找㊂每个样品3次重复取平均值,所有数据分析与处理均采用Excel计算和作图㊂
2㊀研究结果
2.1㊀大白菜CHS基因鉴定结果
㊀㊀通过在TAIR网站查找,共找到1个拟南芥CHS基因,为AT5G13930㊂在BRAD网站中共查
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找到7个大白菜CHS基因(表1)㊂大白菜7个CHS基因碱基数数最少的仅为277个,最多的为1698个,分别为BrCHS6和BrCHS4;氨基酸数最少也是BrCHS6,仅有68个,最多的是BrCHS7,有395个氨基酸㊂与拟南芥CHS基因比较,同源性范围是72.500%~95.707%㊂
表1㊀㊀大白菜与拟南芥中查尔酮合酶基因比较
Table1㊀Comparison of chalcone synthase genes in Chinese cabbage and Arabidopsis
序号大白菜基因名称基因号碱基数氨基酸数同源性/%e值0AtCHS AT5G139301577395 1BrCHS1BraA02g005190.3C145239495.4550 2BrCHS2BraA02g039760.3C126939488.1310 3BrCHS3BraA03g005990.3C145839695.2140 4BrCHS4BraA06g019160.3C169835072.500 6.12ˑ10-89 5BrCHS5BraA09g002250.3C96632189.7520 6BrCHS6BraA09g002260.3C2776888.710 3.76ˑ10-35 7BrCHS7BraA10g024990.3C126339595.7070
㊀㊀注: 表示无此栏㊂
㊀㊀从百迈客提供的所有基因的表达量(fpkm)矩阵文件(All.DEG.final.xls)中查找,共找到3个相对表达量有差异的大白菜CHS基因,分别为BraA02g005190.3C(BrCHS1)㊁BraA03g005990.3C (BrCHS3)和BraA06g019160.3C(BrCHS4)㊂在后续的内容中会详细分析这3个基因在抗㊁感品系及不同氮素水平下的相对表达情况㊂
2.2㊀大白菜CHS基因进化分析
㊀㊀大白菜CHS基因的进化分析,从TAIR和BRAD分别下载了拟南芥和大白菜CHS基因序列,并从NCBI分别下载了油菜(KP301153.1)㊁甘蓝(KP301161.1)㊁芥菜(KP301187.1)和萝卜(KP301239.1)的各一个CHS基因序列,运用MEGA7.0软件[15],采用邻接法构建了CHS基因的系统发育进化树(图1)㊂BrCHS2和BrCHS6分别与其他基因关系较远,尤其是BrCHS6基因与其他基因的关系最远㊂其余基因则基本与拟南芥CHS 基因归在一起(图1)㊂
图1㊀大白菜和拟南芥CHS基因的系统发育树Fig.1㊀Phylogenetic tree of CHS genes in Chinese cabbage and Arabidopsis
2.3㊀大白菜CHS基因结构分析
㊀㊀从BRAD网站获得大白菜CHS基因的核苷酸序列和CDS序列,利用在线软件Gene Structure Display Server(GSDS2.0,http://gsds.gao-lab. org/)[16]绘制大白菜CHS基因结构图(图2)㊂结果显示,大白菜CHS基因一般包含1~5个外显子㊂其中,BrCHS4包含的外显子最多,有5个, BrCHS5包含的外显子数最少,仅有1个,其他5个CHS基因均包含有2个外显子㊂
2.4㊀大白菜CHS基因的染色体定位分析
图2㊀大白菜CHS基因结构Fig.2㊀CHS gene structure in Chinese cabbage
㊀㊀从BRAD网站分别获取大白菜CHS基因所在染色体及起始和终止位置信息,利用在线软件MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)[17]绘制出大白菜CHS基因在染色体上的定位分布图(图3)㊂结果显示,大白菜CHS基因主要分布在5个染色体上,其中2号染色体和9号染色体上分别分布2个CHS基因,另外3号㊁6号和10号染色体各分布有1个CHS基因㊂
图3㊀大白菜CHS基因染色体定位
Fig.3㊀Chromosomal localization of CHS gene in Chinese cabbage
2.5㊀高氮水平下抗性品系CHS基因相对表达量
分析
㊀㊀对抗性品系在高氮水平及正常氮水平下,不同处理时间CHS基因表达水平分析发现3个差异表达的CHS基因,分别是BrCHS1㊁BrCHS3和BrCHS4㊂这3个CHS基因在高氮水平处理下变化趋势一致,即在高氮处理7d时基因相对表达量与对照相比显著增加,而在处理14d时基因相对表达量又恢复到跟正常氮一样水平(图4)㊂
2.6㊀高氮水平下感性品系CHS基因相对表达量
分析
对感性品系在高氮水平及正常氮水平下,不同处理时间CHS基因表达水平分析发现了与抗性品系相同的3个差异表达CHS基因,同样分别是BrCHS1㊁BrCHS3和BrCHS4㊂且这3个CHS基因在高氮水平处理下变化趋势一致,即在高氮处理7 d时基因相对表达量与对照相比显著增加,而在处理14d时基因相对表达量又恢复到跟正常氮一样
水平(图5)㊂
2.7㊀抗、感性品系CHS基因在不同氮水平下相对
表达量比较分析
㊀㊀对抗㊁感性品系在高氮水平及正常氮水平下,
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图4㊀抗性品系CHS基因在高氮水平下相对表达量
Fig.4㊀Relative expression levels of CHS genes in resistant line under high nitrogen levels
图5㊀感性品系CHS基因在高氮水平下相对表达量
Fig.5㊀Relative expression levels of CHS genes in susceptible line under high nitrogen levels
不同处理时间下3个差异表达CHS基因,即BrCHS1㊁BrCHS3和BrCHS4的表达水平进行综合分析发现,3个CHS基因在正常氮水平下抗㊁感品系间相对表达量无显著差异,而在高氮水平处理7d 时感性品系基因相对表达量与抗性品系比较显著增加,处理14d时又都恢复到相同水平(图6)㊂
CK 表示正常水平; HN 表示高氮水平
图6㊀抗、感性品系CHS基因在不同氮水平下相对表达量
Fig.6㊀Relative expression levels of CHS genes in resistant and susceptible strains at different nitrogen levels
3　结论与讨论
查尔酮合酶(CHS)是黄酮类生物合成途径的起始和关键酶㊂黄酮类化合物在植物中扮演着多种重要角色,对植物的生长㊁发育和防御都有重要意义㊂首先,它们是植物次生代谢产物,广泛存在
于蔬菜㊁水果和药用植物中,对植物的生长发育㊁
开花结果以及抵御异体生物入侵起着重要作用;其
次,黄酮类化合物是植物资源中一种典型的活性功
能成分,具有重要的生理功能㊂许多黄酮类成分具
有止咳㊁祛痰㊁平喘及抗菌活性,同时具有护肝㊁
解肝毒㊁抗真菌㊁治疗急㊁慢性肝炎㊁肝硬化及抗
自由基和抗氧化作用[18];此外,黄酮类化合物也是植物化学防御的关键物质之一,它们可以作为抗
菌剂和抗氧化剂等防御物质来保护植物免受病虫害
的侵袭[19]㊂
在本研究结果中,以拟南芥CHS基因序列为
参考,在大白菜基因组中共注释到7个CHS基因,
分别为BrCHS1(BraA02g005190.3C)㊁BrCHS2 (BraA02g039760.3C)㊁BrCHS3(BraA03g005990.3C)㊁BrCHS4(BraA06g019160.3C)㊁BrCHS5 (BraA09g002250.3C)㊁BrCHS6(BraA09g002260.3C)和BrCHS7(BraA10g024990.3C)(表1)㊂研究发现有3个大白菜CHS基因响应高氮胁迫,且抗㊁感品系在高氮水平下的表达水平有差异㊂虽然抗㊁感品系CHS基因的表达水平在高氮处理7d时与对照相比均达到最高,但感性品系CHS表达水平要显著高于抗性品系㊂抗㊁感品系在高氮处理14d 后,CHS的表达水平回落至正常,此时抗㊁感品系在正常氮水平及高氮处理下均没有显著差异㊂这与苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因在高氮水平下转录水平表现完全一致㊂这3个CHS基因分别为BrCHS1㊁BrCHS3及BrCHS4,可能与大白菜叶柄黑点症发生有关㊂
虽然国内外研究人员对大白菜叶柄黑点症发生
的影响因素进行了广泛的探究,但是目前为止引起
大白菜叶柄黑点症发生的具体机制尚不清楚㊂本研
究发现的3个可能与大白菜叶柄黑点症发生有关的CHS基因,BrCHS1㊁BrCHS3和BrCHS4,为进一步从分子水平揭示大白菜叶柄黑点症发生的分子机制及大白菜叶柄黑点症抗病育种工作及防治工作提供理论基础与技术支撑㊂
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(责任编辑:董宇飞)。