第二章-PCR技术ppt课件
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
DNA引物
• PCR反应条件 50℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点 引物1
引物2
PCR的基本原理
Taq酶
DNA引物
• PCR反应条件 50℃ 72℃ • PCR过程 • PCR的特点 引物1
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
2.PCR过程
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
病毒1
病毒2
病毒 3
病毒4
标记引物
ＰＣＲ
PCR产物
观察
5. PCR固相分析法
亲和固 相介质 模 板
PCR 扩增
探 针
检测探 针信号
生物素 化引物
6. 原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－ PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的 细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的 片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检 测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细 胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3’
5’
3’
5’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列 定点突变 探针标记
5.如何选择最合适的DNA聚合酶
• DNA 聚合酶的特性
• PCR 实验的不同需求
（1）DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性
5’
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’
5‘
DNA 聚合酶 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 （ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于 10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准 的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很 高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊 断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内 病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA 表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在 感染方面也具有重要意义。
2）循环参数
(1)变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
第二章-PCR技 术
第一节 PCR技术基础
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 DNA 解旋解链
5’
3’
合成引物
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
解旋酶解链酶
5’
子链延长
3’ 5‘
合成引物
子链延长
3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971 年， Khorana 提出：经过 DNA 变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。 • 但由于测序和引物合成的困难，以 及 70 年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
第二节 PCR的类型和应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
一、类型
1.不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限 制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是 0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
1
2 模板DNA 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5‘
RNA引物 RNA引物
3’
合成引物
5引物酶 ‘
子链延长
3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 活 性
80 60 40
(%)
20 40 100 50 60 70 80 90
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
二、PCR的基本原理
1.标准的PCR反应体系
生物样品
DNA片段
……
基 因 诊 断
基 因 治 疗
基 因 工 程 产 品
法 医 学 检 测
人 类 学 研 究
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物
DNA聚合酶
M13噬菌体
Sanger的 测序技术
Mullis 的构思
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循 环仪
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
7.ＲＴ－ＰＣＲ
mRNA
逆转录酶 杂化双链 ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
基因
mRNA
蛋白质多肽链
实时PCR技术原理
二、PCR技术的应用
适用范围
• 大规模基因检测 • 目的基因拷贝数极低的样本 • GC含量高,有二级结构的模板 • 复杂基因组样本 • 可直接检测菌落，基因点突变检测,
或者阳性克隆的筛选。
6.PCR反应条件 1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
未知序列 已知序列 未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3. 多重PCR
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物
电 泳
4. LP-PCR（Labelled primers)
利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记， 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断
可同时检测多种基因成分
原 理
用 途
• 混合酶 －高扩增效率 － 3’－5’核酸外切
• 超长片段扩增
－测序 －构建基因图谱
• 复杂模板扩增
－GC含量高 －二级结构
高保真 ＋ 高扩增效率
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶
反应缓冲液
dNTP PCR增强剂
PCR Master Mix
特 点
• 快速简便 减少加样误差和污染 • 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 • 特异性强 • 稳定性好 降低PCR反应的要求，增强特异性 长期放置活性无改变
1. 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本的纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
4.引物设计：
（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源
序列。
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。
特 点
用 途
• 避免非特异性扩增 • 提高PCR反应的 特异性 • 基因组扩增
• RT-PCR
特异性
－ 热启动 Taq酶
保真性
— 高保真酶
原 理
• 3’－5’核酸
用 途
•表达基因的克隆
•基因的定点突变 • 细胞内基因点 突变分析（SNP）
外切酶活性
• 降低碱基错配率
保真性
— 高保真酶
高保真 ＋ 高扩增效率
模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增
• • •
PCR的基本原理
第3轮扩增
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
3.PCR的特点
•
灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
（2） PCR 实验的不同需求
特 异 性
保 真 性
基因组扩增、RT-PCR
基因筛选、测序、 基因克隆
长片段扩增 构建基因图谱、测序、分子遗传学 扩增效率
复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）
PCR试剂盒 复杂模板扩增、大规模基因检测
特异性
－ 热启动 Taq酶
原 理
• 蜡封 • 抗体抑制 • 化学修饰
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
DNA引物
• PCR反应条件 50℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点 引物1
引物2
PCR的基本原理
Taq酶
DNA引物
• PCR反应条件 50℃ 72℃ • PCR过程 • PCR的特点 引物1
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
2.PCR过程
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
病毒1
病毒2
病毒 3
病毒4
标记引物
ＰＣＲ
PCR产物
观察
5. PCR固相分析法
亲和固 相介质 模 板
PCR 扩增
探 针
检测探 针信号
生物素 化引物
6. 原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－ PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的 细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的 片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检 测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细 胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3’
5’
3’
5’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列 定点突变 探针标记
5.如何选择最合适的DNA聚合酶
• DNA 聚合酶的特性
• PCR 实验的不同需求
（1）DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性
5’
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’
5‘
DNA 聚合酶 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 （ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于 10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准 的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很 高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊 断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内 病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA 表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在 感染方面也具有重要意义。
2）循环参数
(1)变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
第二章-PCR技 术
第一节 PCR技术基础
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 DNA 解旋解链
5’
3’
合成引物
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
解旋酶解链酶
5’
子链延长
3’ 5‘
合成引物
子链延长
3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971 年， Khorana 提出：经过 DNA 变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。 • 但由于测序和引物合成的困难，以 及 70 年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
第二节 PCR的类型和应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
一、类型
1.不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限 制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是 0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
1
2 模板DNA 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5‘
RNA引物 RNA引物
3’
合成引物
5引物酶 ‘
子链延长
3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 活 性
80 60 40
(%)
20 40 100 50 60 70 80 90
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
二、PCR的基本原理
1.标准的PCR反应体系
生物样品
DNA片段
……
基 因 诊 断
基 因 治 疗
基 因 工 程 产 品
法 医 学 检 测
人 类 学 研 究
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物
DNA聚合酶
M13噬菌体
Sanger的 测序技术
Mullis 的构思
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循 环仪
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
7.ＲＴ－ＰＣＲ
mRNA
逆转录酶 杂化双链 ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
基因
mRNA
蛋白质多肽链
实时PCR技术原理
二、PCR技术的应用
适用范围
• 大规模基因检测 • 目的基因拷贝数极低的样本 • GC含量高,有二级结构的模板 • 复杂基因组样本 • 可直接检测菌落，基因点突变检测,
或者阳性克隆的筛选。
6.PCR反应条件 1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
未知序列 已知序列 未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3. 多重PCR
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物
电 泳
4. LP-PCR（Labelled primers)
利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记， 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断
可同时检测多种基因成分
原 理
用 途
• 混合酶 －高扩增效率 － 3’－5’核酸外切
• 超长片段扩增
－测序 －构建基因图谱
• 复杂模板扩增
－GC含量高 －二级结构
高保真 ＋ 高扩增效率
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶
反应缓冲液
dNTP PCR增强剂
PCR Master Mix
特 点
• 快速简便 减少加样误差和污染 • 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 • 特异性强 • 稳定性好 降低PCR反应的要求，增强特异性 长期放置活性无改变
1. 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本的纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
4.引物设计：
（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源
序列。
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。
特 点
用 途
• 避免非特异性扩增 • 提高PCR反应的 特异性 • 基因组扩增
• RT-PCR
特异性
－ 热启动 Taq酶
保真性
— 高保真酶
原 理
• 3’－5’核酸
用 途
•表达基因的克隆
•基因的定点突变 • 细胞内基因点 突变分析（SNP）
外切酶活性
• 降低碱基错配率
保真性
— 高保真酶
高保真 ＋ 高扩增效率
模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增
• • •
PCR的基本原理
第3轮扩增
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
3.PCR的特点
•
灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
（2） PCR 实验的不同需求
特 异 性
保 真 性
基因组扩增、RT-PCR
基因筛选、测序、 基因克隆
长片段扩增 构建基因图谱、测序、分子遗传学 扩增效率
复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）
PCR试剂盒 复杂模板扩增、大规模基因检测
特异性
－ 热启动 Taq酶
原 理
• 蜡封 • 抗体抑制 • 化学修饰