球孢白僵菌工程菌株构建及其环境安全性分析

球孢白僵菌工程菌株构建及其环境安全性分析

吕丁丁;李增智

【摘要】以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb202作为出发菌株,同时引入外源毒力基因,即北非蝎(Androctonus australis)昆虫特异性神经毒素多肽基因

AaIT(GI:69545),构建高毒力的工程菌株Bb202T-7,并用SPSS软件统计分析,结果显示,Bb202T-7对松墨天牛(Monochamus alternatus)的杀虫效率提高了

11.11％.研究目的是为生物防治提供性能良好的出发菌株,为高效杀虫剂的研制提供基础资源,克服真菌杀虫剂击倒昆虫所需时间长,对环境条件要求高等缺点,加速真菌杀虫剂的产业化步伐.同时对基因工程重组菌株的安全性问题进行分析,并提出解决方案.

【期刊名称】《镇江高专学报》

【年(卷),期】2013(026)001

【总页数】5页(P50-54)

【关键词】球孢白僵菌;AaIT基因;基因工程;环境安全

【作者】吕丁丁;李增智

【作者单位】镇江高等专科学校电子与信息工程系,江苏镇江212003;安徽农业大学安徽省微生物防治重点实验室,安徽合肥230036

【正文语种】中文

【中图分类】S476.12

随着社会经济的发展和人们环保意识的提高，环境友好型生物源杀虫剂的应用越来越受重视。利用昆虫病原真菌加工而成的真菌杀虫剂的应用及基础研究得到了长足的发展，但由于存在击倒昆虫所需时间较长，对环境条件要求高等缺点，真菌杀虫剂的应用受到一定程度的限制。有目的地对生产菌株进行遗传改良，获得高效工程菌并研制高活性新剂型是克服这些弱点的关键，将大大加速真菌杀虫剂的产业化步伐［1］。

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为重要的昆虫病原真菌在害虫的生物防治中发挥着重要作用。

通过基因工程技术提高昆虫病原真菌的毒力是进一步扩大真菌杀虫剂应用范围的有效手段，已经报道的毒力基因高表达是一种行之有效的方法。将带有苯菌灵抗性基因质粒pBENA3与带有体壁降解酶Prl基因的质粒pMAPR-1置于金龟子绿僵菌1080菌株进行原生质体共转化试验，得到的过量表达Prl工程菌株获得了显著提

高的杀虫活性［2］。也可以将外源毒素基因(如北非蝎Androctonus australis昆虫特异性神经毒素多肽基因)导入昆虫病原真菌以提高真菌的杀虫毒力。引入蝎毒

基因AaⅠT而构建的绿僵菌工程菌株对烟草天蛾和埃及伊蚊子(Aedes aegypti)的致死剂量减少至原来的1/20［3］。可见，采用毒力基因或外源毒素基因超量表

达等基因工程技术可以极大地提高虫生真菌的杀虫效率［4］。

本研究主要是构建一个含有外源毒素基因AaⅠT的虫生真菌的工程菌株，获得高

毒力的工程菌株，为生物防治提供性能良好的出发菌株，并为高效杀虫剂的研制提供基础资源，克服真菌杀虫剂击倒昆虫所需要的时间长，对环境条件要求高等缺点，这将大大加速真菌杀虫剂的产业化步伐。同时，本文针对基因工程重组菌株的安全性问题进行深入探讨和分析，并提出一些解决方案以供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

1)菌株。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb202，保藏于安徽农业大学安徽省微生物防治重点实验室，作为转基因的出发菌株。其寄主是松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)，来源于日本。

2)载体。pGPET1由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所王成树课题研究组保存并提供。

1.1.2 主要试剂和工具酶

PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)、RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)和胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)为QINGEN产品。质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

第一链cDNA合成试剂盒(revertra ace-α-)为TOYOBO产品。

DNA marker为上海鼎国生物工程有限公司出品。

Taq酶、dNTP，限制性内切酶类、T4连接酶和去磷酸化酶均为TAKARA产品。1.1.3 主要培养基

1)SDB培养基:DifcoTMSabouraud Dextrose Broth(Becton Dickinson)30 g/L。

2)PDA培养基:Potato Dextrose Agar(青岛高科园海博生物技术有限公司)46 g/L。

3)L-borth培养基:葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母浸出粉 2 g，KH2PO41.52 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.52 g，pH6.8 ～7.0，加蒸馏水至 1000 mL。

4)基础培养基:葡萄糖1%(w/v)，NaNO3 0.6%(w/v)，KCl 0.052%(ω/v)，

MgSO4.7H2O 0.052%(w/v)，KH2PO40.025%(w/v)，琼脂 1.5%(w/v)。

1.2 方法

1.2.1 球孢白僵菌对草胺磷的敏感性测定

分别取草胺磷含量为0 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，150 μg/mL，200

μg/mL，250 μg/mL，300 μg/mL的基础培养基2.5 mL倒入6 cm培养皿。每个梯度倒2皿。

同时，制备孢悬液:在Bb202的平板上刮取少量孢子到4 mL 0.05%的Tween20中，vortex振荡混匀，再用玻璃丝棉过滤，除去菌丝，把滤液的孢子浓度稀释到1×106个/mL。

在抗性平板上涂孢悬液20 μL，在25℃培养箱培养，48 h后开始观察。每隔12 h 或24 h观察1次，记录，统计。

1.2.2 原生质体法转化Bb202

原生质体的制备和转化主要参考相关文献资料［5］。

1.2.3 球孢白僵菌基因组DNA的提取

1)接种 Bb202到 SDB中，离心 150 rpm，摇晃2 d。

2)抽滤菌丝，称取湿菌丝0.1 ～0.2 g。

3)使用快速核酸提取仪，5.0 m/s，10 s，重复2次。

4)加550 μLDNA 提取液和5 μLβ-巯基乙醇，混匀。

5)放置于65℃水浴中30 min。其间，每隔10 min温和混匀1次。

6)加500 μL水饱和苯酚，充分混匀。

7)离心5000 rpm，5 min，转移上清液至一新的1.5 mL离心管中。加500 μL氯仿与异戊醇的混合液，比例为24∶1，混匀。离心5000 rpm，5 min。重复2～3次。转移上清液到一新的1.5 mL离心管中，加500 μL异戊醇，温和混匀。

8)置于－20℃，30 min后，离心12000 rpm，15 min。

9)弃上清液，用70%乙醇清洗沉淀。

10)在室温下干燥几分钟。

11)取300～500 μL EB缓冲液重悬沉淀，即得孢白僵菌基因组DNA。

1.2.4 真菌转化子的PCR初步筛选与验证