实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察

实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察
一、实验原理
简单染色采用一种染料对菌体进行染色，常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。

染色后，
菌体与背景形成鲜明对比，在显微镜下很容易被识别。

通过简单染色方法可以观察细菌的菌
体形态特征和菌体的排列方式。

观察菌体形态 简单染色
（只用一种染料） 观察菌体排列方式
染色方法 革兰氏染色
鉴别
鉴别染色 抗酸性染色
（利用两种染料） 芽孢染色
观察特殊结构 荚膜染色
鞭毛染色
二、实验步骤：
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
三、思考题
1、制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？
答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，否则不易干燥；
取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细胞个体形态
同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。

（2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形；
（3）干燥固定：干燥后加热固定，可避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形；
（4）固定：菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。

注意温度不宜过高，时间不宜太长，否
则菌体形态则会发生改变。

（5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四周冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜部位，水
流不宜过急，过大，至流出水无色为止；
2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察？
答：使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N=1.515），不仅增加了透明度，而且会提
高了分辨率。

若制片不完全干燥后，就用油镜观察，则N 会减小，分辨率D 也会变小。

而且还会造成油
水两相不互溶，所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。

3、如果涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎样
呢？
答：加热固定的作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大
多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。

（1）如果图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。

（2）如果加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生变化甚至破裂。

4、为什么细菌染色常用碱性染料？什么情况下用酸性染料？
答：（1）细菌染色常用碱性染料，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带
负电荷，而碱性染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。

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（2）当细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。

实验二细菌的革兰氏染色法
一、实验原理
革兰氏染色是细菌染色中重要的鉴别染色方法之一。

通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌(G-)。

G+和G-主要是由于细胞壁结构和化学成分的差异引起脱色能力的不同。

①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的化合物。

②乙醇脱色：细胞壁较厚结晶紫与碘液复合物留在细
G+ 胞壁内，使其保持紫色。

肽聚网层次多和交联致密且不含类脂
细胞壁较薄结晶紫与碘复合物溶出，细
G- 胞壁退成无色
肽聚网层薄和交联差，外膜层类脂含量高
③番红染色：G-细菌呈现红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。

二、实验步骤立即水洗干燥
结晶紫碘液G+：蓝色
菌体紫
初染媒染G-G-：红色
1、涂片：“三区”涂片法，在一洁净的载玻片偏左和偏右各加一小滴。

用灭菌的接种环挑取少许枯草芽孢杆菌与右边的水滴充分混合，将左、右方的菌液延伸与玻片中央，使大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在玻片中间区域相互混合成含有两种菌的混合区。

2、干燥：涂片在空气中干燥
3、固定：手持载玻片一端，有菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。

注意用手指触摸载玻片反面为不烫为宜。

冷却。

4、染色：滴加结晶紫染色液于菌膜部位，覆盖菌膜，染色1~1.5min。

5、水洗：斜置玻片倾去染色液，用水自玻片上端缓慢冲洗。

注意勿使水流直接冲洗菌膜部位。

6、媒染：滴加碘液于菌膜部位，覆盖菌膜，放置1~2min。

7、水洗：同上
8、脱色：斜置玻片，自标本的上端缓慢滴加95%乙醇脱色，直到留下的酒精无明显的紫色为止。

脱色是革兰氏染色中的关键一步，注意不要脱色过度。

9、水洗：同上
10、复染：滴加番红染色液，染色1min.
11、水洗并用吸水纸自载玻片边缘轻轻吸去多余水分。

12、镜检。

三、思考题
1、什么是鉴别染色？有何优点？
答：（1）鉴别染色是指至少使用两种不同颜色的染色剂进行染色。

（2）优点：可以区分不同类别的菌种；可以很好地观察菌体结构；
2、革兰氏染色法中初染、媒染、脱色、复染的目的是什么？
答：初染：利用结晶紫初染使所有细菌都着上蓝紫色。

媒染：利用碘液作为媒染剂，碘会与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强染料在菌体中的滞留能力
脱色：用95%乙醇作为脱色剂，根据G+和G-细胞壁机构和化学组成的差异，G+的肽聚网孔会收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，而G-中原先滞留的碘-结晶紫
复合物容易被洗脱下来，菌体变无色。

复染：用番红作为复染剂把洗脱的G-染成红色，而G+仍为蓝紫色。

3、革兰氏染色反应的关键步骤是什么？为什么？
答：革兰氏染色反应的关键步骤是脱色；
①若脱色不够的话，则大肠杆菌中的碘-结晶紫复合物不能被洗脱下来，或无法完全被洗脱下来，那么之后用番红复染时不会变成红色，而是呈紫色，造成大肠杆菌的假阳性。

②若脱色过度的话，则金黄色葡萄球菌中的碘-结晶紫复合物也会被洗脱下来，那么之后用番红复染细胞呈红色，造成金黄色葡萄球菌的假阴性。

实验五酵母菌形态的观察
一、实验原理（略）
二、实验步骤
1、酵母个体形态与出芽繁殖
接种与培养制片观察
2、假菌丝形态
接种与培养制片
3、酵母细胞的死活染色鉴别
涂片、染色观察
三、思考题
1、显微镜下观察的酵母菌的个体形态特征与细菌个体形态特征有何不同?
答：（1）细菌是一类细胞细短的原核生物，一般直径约为：0.5μm，长度约为：0.5~5μm。

显微镜下观察的细菌个体形态基本上是球状、杆状、螺旋状三大类，仅少数为其他形状，如丝状、三角形、方形和圆盘形等；
（2）酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍，是典型的真核生物，在显微镜下观察的酵母菌个体形态通常是有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状等。

2、美蓝色染色液染色时间对酵母菌死活细胞数量有何影响？试对所得的结果进行分析和讨论。

答：美蓝染色液染色时间越长，酵母菌死细胞数量越多，而活细胞数量越少。

实验六霉菌形态的观察
1、试分析Subouraud 琼脂培养基的优点？
答：①pH偏酸性，适合霉菌生长；
②氯霉素可抑制细菌的生长；
2、载片培养法中“U”形玻璃棒和培养皿底部的滤纸上加入适量灭菌水的目的是什么？除了加灭菌水之外，还可以加入什么溶液？
答：①目的是保证培养皿内适宜温湿度；
②还可通过无菌操作在培养小室中园滤纸片上加3至5ml灭菌的20%的甘油。

3、载片培养还适宜哪些微生物进行形态观察？
答：载片培养还适宜培养放线菌、假丝酵母等分枝丝状体进行形态观察。

4、为什么载片培养所用的材料均要灭菌？
答：载片培养所用的材料如不灭菌，则极易引入杀菌，当接种到培养基上时，很有可能会影响霉菌的生长，而且也会影响到后期的显微观察。

实验七微生物测微技术
一、实验原理
显微测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合使用的部件。

镜台测微尺总长1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100 个小格，每一小格长度为0.01mm。

目镜测微尺分50小格和100小格两种。

二、实验方法和步骤
目镜测微尺放置目镜测微尺的标定酵母菌大小的测定将镜台测微尺用擦镜纸擦拭干净，放进盒子里保存，同时正确清理和维护显微镜。

注：放置镜台测微尺时有刻度的一面朝上；目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行；使两尺左边某一区域内两线完全重合后找出右边另外相重合的线，分别数出两重和线。

目镜测微尺每格长度（um）=重合线间镜台测微尺格数*10/重合线间目镜测微尺格数
三、思考题
1、为什么使用不同放大倍数的目镜或者物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
答：因为目镜测微尺在不同放大倍数的目镜和物镜下的大小是不一样的，也就是比例不同，所以要重新校正。

2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同？为什么？
答：相同。

因为同一菌体的大小是一定的，不同放大倍数的物镜不会改变菌体的实际大小，但物镜的放大倍数越高，目镜测微尺的精确度越高，测量月准确。

3、测量菌体大小时对菌龄有无要求？为什么？
答：有要求。

因为菌在不同生长时期细胞大小有时会有较大变化，若需自己制样进行细菌大小测定时，应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料。

实验八微生物技术技术-血球计数板法
一、实验原理
测定细胞数目的方法有直接计数法（如血球计数板计数计数）和间接计数法（如平板菌落计数法）
显微镜计数的优点是直观、快速、操作简单，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。

其中血细胞计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞，霉菌孢子等计数。

二、实验方法和步骤
1、镜检计数板的计数室（在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗）
2、加样品(菌悬液需摇匀）
3、计数(加样后静置5min）
4、清洗血球计数板
注：1、活细胞是透明的，因此在进行显微镜计数时应适当减低视野亮度以增大反差；
2、进行显微计数是应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察计数。

3、酵母菌以每格5到10个菌体为宜。

三、思考题
1、用血球计数板计数时，哪些步骤容易造成误差？应如何尽量减少误差力求准确？
答：容易造成误差的步骤（1）计数室的清洗（2）加样时是否将菌液摇匀（3）计数
尽量减少误差的措施：
(1)加样前应先镜检计数室，若有污物则需清洗后镜检，直至计数室没有污物；
(2)加样前先摇匀菌液，因为放置一段时间的菌液其浓度是不均匀的；
(3)计数时先根据计数板的规格确定计数方法：记上不计下，记左不计右。

2、血球计数板计数有哪些缺点？
答：优点是直观、快速、操作简单，可直接观察到微生物的总数，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。

3、利用血球计数板计数时，注入的菌液为什么不能过多？
答：（1）注入菌液过多，会将盖玻片顶起而改变计数室的容积。

（2）注入菌液过多，也会使计数室中格线变得模糊，无法清楚的计数。

实验九培养基的制备与高压蒸汽灭菌
一、实验原理
培养基是人工配置的适合我微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等六大营养物质。

一般培养细菌的常用营养琼脂培养基，放线菌常用高氏一号培养基，酵母菌常用麦芽汁培养基，霉菌常用马铃薯培养基（PDA）。

高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min。

二、思考题
1、为什么分装于三角瓶中的培养基装量不能过多？
答：①分装量太多，三角瓶内培养极易沾染瓶口及棉塞而造成污染；②分装量太多不利于震荡摇匀；③分装量太多会使培养基灭菌不彻底。

2、配置培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意什么问题？为什么？
答：（1）按培养基配方称取所需药品（2）加入少量水溶解（3）待完全溶解后加水补足至所需体积，调节PH（4）分装（5）灭菌
3、试分析培养基灭菌不彻底的原因。

答：（1）装有培养基的试管和三角瓶等在灭菌前没有包扎好；
（2）分装时培养基沾在管口；
（3）高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，致使温度没有达到121℃；
（4）灭菌锅内物品装的太挤，妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果；
（5）灭菌锅内三角烧瓶与试管口与锅壁接触，冷凝水会淋湿包口的纸而透入棉塞；
（6）灭菌结束后，压力未降到0即打开排气阀，开盖取物。

这时锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

4、举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养均？其PH值如何？
答：细菌：营养琼脂培养基PH 7.0-8.0
放线菌：高氏一号培养基PH 7.5-8.5
酵母菌：麦芽汁培养基PH 3.8-6.0
霉菌：马铃薯培养基PH 4.0-5.8
5、在使用高压蒸汽锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？
答：（1）在灭菌前一定要检查灭菌锅中是否有水，若没有水或水不够要及时加水（最好是去离子水）否则灭菌锅可能会烧干而引起炸裂事故。

（2）灭菌结束后，注意压力一定要降到0，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因为锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼烧操作者。

（3）灭菌时，旁边一定要有人观察灭菌锅是否处于正常使用状态。

实验十玻璃器皿的清洗、包扎和干热灭菌
一、实验原理
干热灭菌的条件为：160~170℃，维持时间：1~2h ，适用对象：玻璃器皿、金属器皿机械和其他物品（如石蜡油）等的灭菌。

二、思考题
1在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
答：灭菌前：[1]电热干燥箱中玻璃器皿不要放置地过于紧密，否则会灭菌不够彻底
[2]开始灭菌，设定温度为160℃，当干燥箱中温度达到160℃时，灭菌1~2h
[3]注意干热灭菌过程严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故，灭菌时人不能离开
灭菌后：[4]不要立即打开电热干燥箱，否则会因为内外温差过大而引起玻璃器皿的破裂，灭菌结束后应先关闭电源，放置一段时间后再拿出。

2为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间要长？
答：高压蒸汽灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。

干热灭菌也是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。

细胞内蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，菌体受热时环境和细胞内含水量越大，蛋白质凝固就越快，反之含水量少，凝固慢。

因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高，时间更长。

3玻璃器皿为什么在干热灭菌前要先行干燥？
答：干热灭菌温度一般在160~170℃，若玻璃器皿上有过多的水，可能会引起炸裂。

实验十一微生物接种与培养技术
一、实验原理
只有一种微生物的培养物为纯培养，通常情况下只有纯培养物才能可以提供重复的结果，所以纯培养技术是进行微生物学研究的技术。

接种时必须是严格的无菌操作，通常，斜面接种、固体接种、液体接种、穿刺接种均以获得良好的纯种微生物为目的。

其中，穿刺接种可以检测出菌体是否有鞭毛以及哪个方向运动。

二、思考题
1、接种前为什么要灼烧接种环？
答：为了保证纯种微生物在接种过程中不被污染（接种前），以及实验操作用的微生物不污染周围环境（接种后），接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。

2、为什么要待接种环冷却后才能与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上冷却？如何知道接种环是否已经冷却？
答：若不冷却，会烫死菌种；不能直接放台子上冷却，会引入杂菌，若要冷却接种环可以将其在试管内壁上或者未长菌的培养基上接触一下。

当无嗞嗞声或者培养基不熔化是接种环冷
却。

3、若你接种的培养物出现杂菌，如何分析引起杂菌的原因？
答：①培养基及相关器皿是否灭菌彻底；②接种器具及接种环境是否干净；③接种操作是否正确规范；④接种后菌的培养是否正确。

4、斜面培养物出现水膜现象，请问如何避免水膜的行成？
答：①斜面培养基灭菌后经过干燥再用于接种；②接种后试管的塞子不要塞的太紧，以防灭菌后所余水及菌种生长旺盛生成的水留在试管内行成水膜。

5、为什么平板培养时需要倒置？
答：空气不易进入，从而不易引入杂菌，特别是在培养厌氧菌时，倒置可隔绝氧气的进入，从而可以使厌氧菌更好的生长。

另外，平板培养时倒置可防止平板内微生物进入周围环境中，从而污染空气，特别是一些致病菌。

而且，若不倒置，会行成水膜，影响划线。

实验十二微生物计数技术——平板菌落计数法
一．思考题
1、为什么融化后的培养基要冷却到45℃左右才能倒平板？
答：温度过高会烫死菌种，温度过低则培养基会凝固，不利于培养基与菌液混合均匀
2、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪些关键？
答：（1）菌悬液细胞密度适宜，稀释倍数适宜；（2）吸样量准确；（3）混合均匀；（4）更换吸管；（5）加培养基时立即摇匀；（6）涂布均匀；
3当平板上的菌落不均匀而是集中的你认为问题在哪？
答：（1）涂布或倾注不及时；（2）涂布不均匀；（3）没有立即摇匀；（4）菌液过少不易涂布；
4、用平板倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么平板倾注要培养较长时间后观察结果？
答：（1）平板倾注法：菌落出现在平板表面及内部；涂布法：只在平板表面；（2）培养时间长，菌落的形态特征才明显，便于观察计数。

5平板计数的优缺点有哪些？
答：优点：可直接反映样品中活细胞数量；计数的线性范围大；菌落分布均匀，能较好的反映疏密程度，重复性强，平行性好。

缺点：操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素影响。