食品过敏原的检测与分析

食品过敏原的检测与分析
食品过敏现已成为一个新兴的公众性健康问题，特别是在发达国家，调查显示全世界范围内有１％～２％的成年人对食品过敏，而低于三岁的儿童中有８％以上对食品过敏。

产生的临床症状包括皮肤反应（荨麻疹、血管性水肿、湿疹），呼吸症状（哮喘、鼻炎），肠胃症状（呕吐、腹泻、肠胃痉挛），系统反应（心血管症状包括过敏性休克）等。

在过去的几十年中，食品过敏的发病率和流行情况日益增加，给临床变态反应学和食品工业造成了巨大的压力。

加上现在人们生活习惯的改变，饮食面的快速拓宽，特别是转基因食品的大量涌现，过敏症状亦趋于多样化、复杂化和严重化。

因此，对食品过敏原的检测与分析就是一个极其重要的问题。

一般来说，食品过敏原为分子量介于10000～70000之间的蛋白或糖蛋白，占食品总蛋白的极小一部分，分别属于不同的蛋白家族。

但是微量的食品过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应。

系统全面、精确可靠的食品过敏原检测和分析技术体系正在形成，本文对这一研究领域的研究进展进行了详细的综述性分析。

１.利用人血清特异性lgＥ检测食品过敏原
过敏原与lgＥ结合是过敏原体现其生物活性的中心环节，因此食品过敏原检测过程中特异性lgＥ的血清学检测必不可少。

对于能够引起５０％病人产生过敏反应的主要食品过敏原必须测定特异性lgＥ与食品过敏原结合的能力，包括引发过敏反应的频率，热稳定性和水解稳定性等。

但是这种方法不能解决食品过敏原的交叉致敏问题，因为它是用单个过敏病人的血清进行检测的。

１．１RAST抑制实验和EAST抑制实验
自从lgＥ成功纯化及抗lgＥ抗体的制备后，放射过敏原吸附实验（ radio allergosorben t test RAST）得以设计应用。

之后改进的酶标记过敏原吸附实验（enzyme linked allergos orbent assays,EAST）及荧光和化学发光标记的检测技术也均已建立。

这些方法均是检测特异性lgＥ与过敏原相互作用的免疫分析方法。

特异性lgＥ抗体与食品过敏原的结合在固相载体表面进行并被检测，是体外食品过敏诊断的一种已标准化的方法，得到广泛使用。

在此基础上进一步建立了放射过敏原吸附抑制实验（radio allergosorbent test RAST 抑制实验）和酶标记过敏原吸附抑制实验技术（ enzyme linked allergosorbent assays,EAST抑制实验）。

在体外过敏原检测实验中，这些方法是目前国际上变态反应临床及科研人员使用最广泛、最灵敏的
方法，也是评价过敏原总致敏活性的关键技术。

其优点是全自动荧光酶联免疫技术，避免人工实验操作带来的误差，保证了它的灵敏性和准确性，同时解决了不同食品过敏原的交叉致敏问题。

因此在国际上不同实验室之间，ＲＡＳＴ抑制实验技术和统计分析方法按统一的程序进行，每年还有定期的全球质量控制检测以保证仪器正常运行和结果可靠。

目前，在国外大医院、主要过敏原生产企业基本都使用法玛西亚公司ＵｎｉＣＡＰ系统进行ＲＡＳＴ抑制实验。

此外，ＲＡＳＴ抑制实验还是过敏原生产厂商比较每一批过敏原制剂和内部参考品差异的主要方法。

ＲＡＳＴ和ＥＡＳＴ抑制实验已经被用来检测和分析一系列食品的致敏性，如生海鲜和比萨饼中的鳕鱼过敏原；含有花生的食品和花生油等相关产品的致敏性；大豆相关食品的致敏性；榛实过敏原的热稳定性和水解稳定性研究；坚果类食品的交叉致敏作用等。

ＲＡＳＴ和ＥＡＳＴ抑制实验的一个主要不足是对人血清的依赖性，血清是很难保证一致的，因此这两种方法也难以标准化。

尽管它们可以很好的检测食品过敏原，但是人lgＥ抗体特异性的不确定性大大限制了这些方法在更宽领域的应用。

此外，商业化的食品过敏原固相载体与lgＥ的结合能力也不尽相同。

所有这些都限制了ＲＡＳＴ和ＥＡＳＴ抑制实验在食品过敏原定量检测中的应用。

总体上来说，ＲＡＳＴ和ＥＡＳＴ抑制实验是检测各种形式的食品过敏原蛋白（蛋白粗提物，纯化的过敏原样品，不同物种、食品中过敏原）与lgＥ结合能力的较为理想的方法。

１．２ＩＥＦ－ＰＡＧＥ和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ免疫印迹实验
通过等电聚焦（ＩＥＦ）和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳（双向电泳也包括在内）结合免疫印迹分析可以进行单个食品过敏原的分离。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ免疫印迹目前可以用于几乎所有的食品过敏原的分析。

双向电泳常用于检测分子量相近但等电点、氨基酸序列不同的同源性蛋白分子。

与ＲＡＳＴ和ＥＡＳＴ类似，免疫印迹方法同样可以通过lgＥ抑制实验来消除不同来源的不同食品过敏原之间的交叉反应。

２用单克隆或多克隆抗体检测食品过敏原
为了克服用人血清lgＥ抗体检测食品过敏原的不足，依赖于兔、鼠、绵羊、山羊、鸡等的动物抗血清免疫分析方法逐渐发展起来。

这些抗体检测激发免疫作用抗原的效果要比过敏原好。

２．１双免疫扩散实验（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）
这是一种比较两种或两种以上食品过敏原的定性检测分析方法。

将抗体和各种不同的样品
蛋白同时放进孔中，令其相互向对方自由扩散，在达到平衡时会形成一条沉淀线。

双免疫扩散实验可以区分一致的、不一致的和部分一致的蛋白样品。

ＭＡＬＭＨＥＤＥ
ＮＹＭＡＮ等利用双免疫扩散实验检测分析了意大利面食和荞麦食品中的麦麸蛋白。

该方法的不足是不能进行定量分析，灵敏度较低，而且比较费时（２４～４８ｈ）。

２．２点免疫印迹实验
最近报道了点免疫印迹实验在各种食品中检测花生过敏原中的应用。

将样品滴在预先用花生蛋白抗体包埋的一张聚酯底物上，再用二抗进行免疫检测即可检测到已经结合的花生蛋白。

这种方法灵敏度很高而且使用成本较低。

２．３火箭免疫电泳实验（ＲＩＥ）
该分析方法是通过含有抗体的凝胶进行检测分析的。

样品中的蛋白根据各自的电泳移动速率进行移动，直到按照抗体／抗原的比例常数在凝胶上形成“火箭”状的沉淀。

火箭状沉淀区的颜色的深浅与样品中蛋白的丰度直接相关。

所形成的沉淀既可以用考马斯亮蓝染色也可以用免疫染色（后者的灵敏度更高）。

ＲＩＥ应用于食品过敏原检测的报道较为少见。

ＭＡＬＭＨＥＤＥＮＹＭＡＮ等用ＲＩＥ检测了各种食品中鸡蛋、牛奶、榛实和花生蛋白的存在，但是没有指出数据的回收率和重现性。

ＲＩＥ的不足就是实际操作过程中制胶和染色的操作复杂。

２．４酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ是一种酶免疫方法，２０世纪９０年代末期ＥＬＩＳＡ技术发展迅
速，加以全自动酶标分析仪的应用，使ＥＬＩＳＡ的特异性和灵敏度有了很大的提高，在食品检测领域中的应用大大扩展。

ＥＬＩＳＡ的特点是抗原或抗体的固相化和酶标记，在目前最常用的ＥＬＩＳＡ中，抗体要结合在固相载体的表面与样品蛋白（抗原）自由反应。

抗体和抗原反应后用另外一种用酶标记的抗体（二抗）来检测已经反应结合在固相载体表面的样品蛋白（抗原）。

结合在固相载体表面的抗体一定时，与之结合的样品蛋白（抗原）越多，酶标记的抗体的颜色反应就越强，同时血清抗体的浓度越高，ＥＬＩＳＡ显色也越强。

为了能够检测痕量的食品过敏原ＥＬＩＳＡ中使用了生物素标记的二抗和含有过氧化物酶的链霉亲和素。

在食品安全方面ＥＬＩＳＡ技术已广泛应用于兽药残留、农药残留、疫情、有害微生物、动植物毒素等的快速检测分析，并取得了较好的效果。

随着人们对食品过敏认识的深入和重视程度
的加强，现在发展了很多种ＥＬＩＳＡ方法用于食品过敏原总蛋白提取物和特殊食品过敏原的检测和定量分析。

ＥＬＩＳＡ已经成为一种系列化、微量化、商品化的食品安全快速检测方法，是目前应用最广泛的生物检测技术之一。

３ＰＣＲ分析
食品过敏原检测的一个新靶标就是特殊食品蛋白的ｃＤＮＡ。

ＤＮＡ分子可以通过ＰＣＲ技术扩增，在ＰＣＲ过程中ＤＮＡ分子的引物也得到了扩增。

产物即可利用分子量的大小在琼脂糖电泳上进行分离。

一般来说通过引物的选择可以使具有一定同源性的ＤＮＡ分子之间的交叉反应降低到最低程度，尽可能的避
免假阳性结果的产生。

ＰＣＲ扩增技术一般用来对各种食品中经基因修饰的成份（如转基因大豆和转基因玉米）的检测和定量分析。

而直到现在，只有两种ＰＣＲ方法专门针对食品过敏原（榛实和小麦）的检测（表１）。

两种方法均具有很高的灵敏度，都可以达到０．００１％。

３．１研究食品的ＤＮＡ性质（质量）
尽管麦片中麦胶蛋白的检测限度低于０．２ｍｇ／１００ｇ，但是用小麦ＰＣＲ系统分析燕麦糠制造的酸乳酪布丁样品
时只有二分之一的结果显示阳性，麦胶蛋白含量大于１ｍｇ／１００ｇ。

因此，与小麦ＰＣＲ检测方法的高灵敏度相比，对这些样品用ＥＬＩＳＡ检测试剂盒更为合适。

ＨＯＬＺＨＡＵＳＥＲ等［１１］对烤榛实（１４０℃，３０ｍｉｎ）中低丰度主要榛实过敏原Ｃｏｒａ１（０．００１％）的ＤＮＡ进行了扩增（与巧克力和其他不同的食品中榛实蛋白的含量一致）。

而且不同的食品类型也大大影响了过敏原ＤＮＡ的定量检测限度。

也有人应用ＰＣＲ技术研究了食品处理过程相关参数对面包类食物中转基因大豆和转基因玉米成分检测的影响［１３］。

结果发现在研究的食品（面包和蛋糕）中含量低于０．５％转基因玉米的ＤＮＡ是检测不到的，而经过各个加工步骤（包括２００℃烤３０ｍｉｎ）后得到的白面包中加入的０．３％转基因大豆的ＤＮＡ是可以检测的。

这就说明在用ＰＣＲ技术检测过敏原ＤＮＡ时一定要考虑食品处理过程中过敏原ＤＮＡ的降解。

３．２与ＥＬＩＳＡ的对比
ＥＬＩＳＡ可以检测食品样品中已知来源（包含过敏原）的蛋白，而ＰＣＲ可以在相
关蛋白不存在的情况下检测其ＤＮＡ的存在。

因此，ＰＣＲ技术增加了食品中存在过敏原假阳性测定结果的机率。

ＰＣＲ方法的优点是比较快，如果要研究已知序列的ＤＮＡ，这个分析过程只需要７～１０ｄ。

对于一个已经纯化的过敏原，ＥＬＩＳＡ分析要用一个月甚至更长时间，此外，制备其特异性的抗体要再加一个月。

ＰＣＲ技术是以简单、确定的ＤＮＡ序列为基础的，而ＥＬＩＳＡ分析却要依赖于质量稳定的动物抗体。

将来重组抗体将有助于抗血清的标准化。

加工食品中ＤＮＡ和蛋白的稳定性都是要考虑的重要因素。

总之，ＰＣＲ技术适合于复杂食品中过敏原的定量分析，在这方面应该得到大力推广。

４组胺释放实验（ＨＲＴ）
组胺释放实验（ｈｉｓｔａｍｉｎｅｒｅｌｅａｓｉｎｇｔｅｓｔ，ＨＲＴ）主要是通过食品过敏原激发致敏的靶细胞，引起细胞释放组胺，组胺含量可应用荧光测定法、放射免疫法等方法测定，与适宜参照进行比较，确定组胺释放率阳性标准，从而进行过敏原活性测定及鉴定的一类方法。

通常用抗ＩｇＥ抗体作阳性参照，以样品介质（如ＰＢＳ）为阴性参照，以排除实验过程中组胺的非特异性释放。

此外，某些待测过敏原或提取物本身含有组胺，并且待检过敏原或其共存物可能具有靶细胞毒性，引起组胺非特异释放，因此，必须设样品对照及非致敏靶细胞对照。

为了排除生物胺如尸胺、腐胺对荧光法测定组胺的干扰，有报道利用玻璃纤维包被的微量滴定板（ｇｌａｓｓ－ｆｉｂｒｅｃｏａｔｅｄｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）来分离组胺与干扰成分。

肝素化洗涤血（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄｗａｓｈｅｄｂｌｏｏｄ）不用进一步分离便可测定，也可直接应用全血或密度富积的Ｂａｓ进行测定。

该改良方法只需２５ul 全血，可实现微量化操作。

ＮＯＲＧＡＡＲＤ等将ＨＲＴ用于鸡蛋和牛奶过敏原的检测和诊断时发现该方法具有较好的灵敏度，结果的重现性很好，但是食品的状态（是否新鲜）对其影响较为显著。

在鳕鱼过敏原的检测试验中发现与双盲对照试验相比ＨＲＴ具有较高的特异性和较低的灵敏度，但新鲜鳕鱼的过敏原提取物可以显著增强ＨＲＴ检测的灵敏度。

此外，ＨＲＴ还成功的用于花生、榛子过敏原的检测及致敏作用机理的研究。

５过敏原指纹图谱快速检测方法
中药指纹图谱是在制定中药质量评价的过程中针对中药中成分的复杂性以及缺乏用以鉴定
成分所需的化学对照品这一症结而产生的一种方法，是在中药化学成分色谱指纹图谱的基础上发展而来的。

指纹图谱最早的概念来源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学,是最新科技成果与最古老的医学科学传统相结合的结果。

作为一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，中药指纹图谱在研究方法上具有整体性、模糊性和可以量化的特点，其在中医药界的应用受到全世界范围内的认可。

鉴于指纹图谱的实用性和科学性，食品与中药诸多方面的相似性，吴海强等首次提出将指纹图谱的原理和技术应用到食品安全相关的研究中去，特别是应用到食品过敏原的快速检测、分析上来。

以常见过敏食品为研究对象，提取其过敏原总蛋白，初步研究了食品过敏原总蛋白２－ＤＥ指纹图谱在食品过敏原快速检测中应用的可行性，肯定了该方法在不同检测仪器和试验耗材之间良好的重现性和稳定性，并在此基础上进一步研究了以２－ＤＥ指纹图谱为基础进行特异性过敏原蛋白点ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ指纹图谱研究的可行性。

显示了较好的分析结果，为指纹图谱技术在食品过敏原快速检测、分析中的应用提供了坚实的理论基础和实验基础。

总的来说，免疫分析技术为天然的食品原料、半成品和成品都提供了一种特异性强、灵敏度高而且速度很快的痕量过敏原检测方法。

而且现在有了针对食品中鸡蛋、牛奶、花生、小麦等过敏原的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒。

但是需要开发成本低、检测面广的试剂盒来适应形势的发展。

尽管ＰＣＲ技术最具开发前景，但是食品处理过程中ＤＮＡ的变性作用和该方法的最大检测限度限制了它在当前的应用和发展。