南京农业大学生命科学学院生物化学技术原理及应用
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、有些化合物的含量极微，如激素等。 3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变变性
破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。 4、生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，
实验方法经验性较强。
生物大分子物质的制备
❖ 制备方法的选择
生物大分子制备方法的选择是以生物大分子的理化 性质为依据的。对于理化性质不同的生物大分子， 所选用的分离提纯方法也不相同。
或者说生物化学是研究生命现象中的物质基础和化学 变化的一门科学。
更简单地说生物化学就是研究生命现象的化学本质。 生物化学就是生命的化学。
引
言
❖ 生物化学研究的主要目的
从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。
❖ 生物化学的研究对象
生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元 素以及水和无机盐代谢。
生物大分子的理化性质与分离纯化方法的选择
理化性质 分子大小和形态
溶解度 电荷差异 生物功能专一性
分离及纯化方法 差速离心、超滤、分子筛、透析 盐析、萃取、分配层析、结晶 电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析
亲和层析
生物大分子物质的制备
1. 生物材料的选择
选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好； 来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价 值等。
❖ 生命科学是一门实验的科学，其发展有赖于实验技术 的进步。
❖ 生物化学研究自进入分子生物化学阶段以来，生化研 究实验技术飞速发展，特别是近20年来，生物化学新 技术、新方法不断涌现，为生化研究工作者提供了有 用的工具。
生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究技术：
分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、 离心、层析、电泳等；
❖参考资料：
《生物化学技术原理及应用》赵永芳 科学出版社
《生物化学实验原理和方法》余瑞元 北京大学出版社
《生物化学技术》 王小莉
中国轻工业出版社
《现代生化技术》 郭 勇
华南理工大学出版社
《生物化学实验技术原理和方法》 王泽宪 中国农业出 版社
互联网 （引用图片）
目录
❖ 第一章 ❖ 第二章 ❖ 第三章 ❖ 第四章 ❖ 第五章 ❖ 第六章 ❖ 第七章 ❖ 第八章 ❖ 第九章 ❖ 第十章
生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结 构、功能、结构与功能的关系。
生物大分子的代谢和相互作用。
引
言
❖ 生物化学研究的三个主要发展阶段：
叙述生物化学阶段（1770～1903 年）。又称为静态 或形态生物化学，研究内容以分析生物体内物质的化 学组成、性质和含量为主。
动态生物化学阶段（1903～1950 年）。又称为生理 化学。主要研究生物体内组成物质的化学变化及相互 转变。
析等
❖ 这些大分子物质在生物体内具有各种生理活性，这些 活性的产生与其结构有着密切关系，因此，分离此类 物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊 的方法。
生物大分子物质的制备
❖ 生化分离方法与一般化学分离法相比的特点：
1、生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种 化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代 谢变化，如蛋白质和核酸的水解。
生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工 生物材料。 天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物 含量较高的生物个体、器官或组织。 人工生物材料又分为三种： 新品种材料，组织培养 材料，生物产品与生物制品材料。
生物大分子物质的制备
2. 细胞的破碎
机械破碎：研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法
概述（生物大分子的制备） 沉淀法 膜分离技术 离心技术 电泳技术 层析技术 光谱与质谱 基因重组与基因分析 蛋白纯化与蛋白分析 流式细胞术（专题讲座）
第一章 概述
1 引言 2 生物化学研究技术与方法 4 生物大分子物质的制备
2021/6/27
3
51班
引
言
❖生物化学的概念及其研究内容
生物化学是研究生物体的物质组成和生命过程中的化 学变化的一门科学。
溶解度。
氧化 —— 蛋白质巯基易受氧化 金属离子 ——蛋白质巯基能与部分金属离子产生沉淀复合物 抽提液与抽提物的比例 —— 抽提液与抽提物比例一般以
5:1为宜。
生物大分子物质的制备
4. 生物分子的浓缩
❖ 沉淀法：沉淀法包括：盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点 沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热 变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。
生物大分子物质的制备
5. 有效成分纯度和性质分析
鉴定生物制品纯度的方法：电泳、免疫分析、薄层层析和 薄膜层析等
检测含量和性质的方法：光谱法、气象色谱等 测定有效成分分子质量的方法：凝胶过滤、电泳、超速离
心等 核酸序列测定的方法：化学直读法、酶解直读法等 测定蛋白质序列的方法：Endman降解法相结合的薄膜层
功能（实验设计与方法） 代谢及其细胞调控 改造及利用
生物化学研究技术方法
❖ 经典的研究步骤：
分离生化组分（细胞器和 生物分子）；
分析生化组分的结构；
分析生化组分的功能和代 谢（合成与分解）及其相 互作用。
生命现象
改
分离
造
利
生化组分
用
分析
1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控
生物化学研究技术方法
生物酶降解：生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞
时，先是细胞壁降解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，
最后导致细胞完全破碎。
生物大分子物质的制备
3. 生物分子的抽提
抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分 分离出来的过程。
抽提所用溶剂可以是缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（ 如丙酮、乙醇等），也可以是蒸馏水。
分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技 术、分子标记等。
分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与 反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。
生物化学研究技术方法
❖ 研究技术的选择： 实验的目的：定性分析与定量分析； 分离或分析物的物理化学性质； 研究技术的精确性、准确性及检测限； 研究成本； 潜在的风险装置中，在减压 真空状态下进行蒸馏。
❖ 冰冻干燥法：冰冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直 接变为气体。通过该法所得产品能保持生物大分子的天然 性质，还具有疏松，易于溶解的特性，便于保存应用。
因为生物大分子通常遇热不稳定，极易变性，浓缩和干燥生物大分子 不能用加热蒸发的方法。因此减压浓缩和冷冻干燥已成为生物大分子 制备过程常用的浓缩干燥技术。
溶胀和自溶
溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中， 由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的 现象。
自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用， 发生溶解的现象。
化学处理：用脂溶性的溶剂（如丙酮等）或表面活性剂（SDS）处
理细胞时，可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放 出各种酶类物质，并导致整个细胞破碎。
生物大分子物质的制备
❖ 生物大分子的制备
生物大分子的制备过程包括选材、细胞破碎和细胞器 分离、生物大分子提取纯化、以及样品浓缩干燥和储 存等。
1. 生物材料的选择 2. 细胞的破碎 3. 生物分子的抽提 4. 生物分子的浓缩 5. 有效成分纯度和性质分析
生物大分子物质的制备
❖ 生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢 时产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。
提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小 ；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作 安全等。
❖ 抽提的影响因子：
pH —— 溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的
物质都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。
溶剂极性与离子强度 水解酶 —— 有效成分易遭水解酶破坏 温度 —— 一般酶或蛋白在低温（0℃）时最稳定。 搅拌 —— 搅拌可促使抽提物与抽提液的相互接触，并增加
❖ 吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水， 提取液的体积可缩小三倍左右。若凝胶对有效成分的吸附 能力强，或影响其性质，则不宜采取此法。
❖ 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力 下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。
生物大分子物质的制备
4. 生物分子的浓缩
❖ 透析浓缩法：透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半 透膜而进行纯化的一种方法。
功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生 命的本质和奥秘：运动、神经、内分泌、生长、发育 、繁殖等的分子机理 。
生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
观察：生命现象
分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物 。 （抽提、过滤、离心、色谱）
分析：
结构与性质（序列分析，X-射线晶体衍射，核磁共 振，波谱，质谱等）
破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。 4、生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，
实验方法经验性较强。
生物大分子物质的制备
❖ 制备方法的选择
生物大分子制备方法的选择是以生物大分子的理化 性质为依据的。对于理化性质不同的生物大分子， 所选用的分离提纯方法也不相同。
或者说生物化学是研究生命现象中的物质基础和化学 变化的一门科学。
更简单地说生物化学就是研究生命现象的化学本质。 生物化学就是生命的化学。
引
言
❖ 生物化学研究的主要目的
从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。
❖ 生物化学的研究对象
生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元 素以及水和无机盐代谢。
生物大分子的理化性质与分离纯化方法的选择
理化性质 分子大小和形态
溶解度 电荷差异 生物功能专一性
分离及纯化方法 差速离心、超滤、分子筛、透析 盐析、萃取、分配层析、结晶 电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析
亲和层析
生物大分子物质的制备
1. 生物材料的选择
选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好； 来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价 值等。
❖ 生命科学是一门实验的科学，其发展有赖于实验技术 的进步。
❖ 生物化学研究自进入分子生物化学阶段以来，生化研 究实验技术飞速发展，特别是近20年来，生物化学新 技术、新方法不断涌现，为生化研究工作者提供了有 用的工具。
生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究技术：
分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、 离心、层析、电泳等；
❖参考资料：
《生物化学技术原理及应用》赵永芳 科学出版社
《生物化学实验原理和方法》余瑞元 北京大学出版社
《生物化学技术》 王小莉
中国轻工业出版社
《现代生化技术》 郭 勇
华南理工大学出版社
《生物化学实验技术原理和方法》 王泽宪 中国农业出 版社
互联网 （引用图片）
目录
❖ 第一章 ❖ 第二章 ❖ 第三章 ❖ 第四章 ❖ 第五章 ❖ 第六章 ❖ 第七章 ❖ 第八章 ❖ 第九章 ❖ 第十章
生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结 构、功能、结构与功能的关系。
生物大分子的代谢和相互作用。
引
言
❖ 生物化学研究的三个主要发展阶段：
叙述生物化学阶段（1770～1903 年）。又称为静态 或形态生物化学，研究内容以分析生物体内物质的化 学组成、性质和含量为主。
动态生物化学阶段（1903～1950 年）。又称为生理 化学。主要研究生物体内组成物质的化学变化及相互 转变。
析等
❖ 这些大分子物质在生物体内具有各种生理活性，这些 活性的产生与其结构有着密切关系，因此，分离此类 物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊 的方法。
生物大分子物质的制备
❖ 生化分离方法与一般化学分离法相比的特点：
1、生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种 化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代 谢变化，如蛋白质和核酸的水解。
生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工 生物材料。 天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物 含量较高的生物个体、器官或组织。 人工生物材料又分为三种： 新品种材料，组织培养 材料，生物产品与生物制品材料。
生物大分子物质的制备
2. 细胞的破碎
机械破碎：研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法
概述（生物大分子的制备） 沉淀法 膜分离技术 离心技术 电泳技术 层析技术 光谱与质谱 基因重组与基因分析 蛋白纯化与蛋白分析 流式细胞术（专题讲座）
第一章 概述
1 引言 2 生物化学研究技术与方法 4 生物大分子物质的制备
2021/6/27
3
51班
引
言
❖生物化学的概念及其研究内容
生物化学是研究生物体的物质组成和生命过程中的化 学变化的一门科学。
溶解度。
氧化 —— 蛋白质巯基易受氧化 金属离子 ——蛋白质巯基能与部分金属离子产生沉淀复合物 抽提液与抽提物的比例 —— 抽提液与抽提物比例一般以
5:1为宜。
生物大分子物质的制备
4. 生物分子的浓缩
❖ 沉淀法：沉淀法包括：盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点 沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热 变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。
生物大分子物质的制备
5. 有效成分纯度和性质分析
鉴定生物制品纯度的方法：电泳、免疫分析、薄层层析和 薄膜层析等
检测含量和性质的方法：光谱法、气象色谱等 测定有效成分分子质量的方法：凝胶过滤、电泳、超速离
心等 核酸序列测定的方法：化学直读法、酶解直读法等 测定蛋白质序列的方法：Endman降解法相结合的薄膜层
功能（实验设计与方法） 代谢及其细胞调控 改造及利用
生物化学研究技术方法
❖ 经典的研究步骤：
分离生化组分（细胞器和 生物分子）；
分析生化组分的结构；
分析生化组分的功能和代 谢（合成与分解）及其相 互作用。
生命现象
改
分离
造
利
生化组分
用
分析
1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控
生物化学研究技术方法
生物酶降解：生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞
时，先是细胞壁降解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，
最后导致细胞完全破碎。
生物大分子物质的制备
3. 生物分子的抽提
抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分 分离出来的过程。
抽提所用溶剂可以是缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（ 如丙酮、乙醇等），也可以是蒸馏水。
分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技 术、分子标记等。
分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与 反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。
生物化学研究技术方法
❖ 研究技术的选择： 实验的目的：定性分析与定量分析； 分离或分析物的物理化学性质； 研究技术的精确性、准确性及检测限； 研究成本； 潜在的风险装置中，在减压 真空状态下进行蒸馏。
❖ 冰冻干燥法：冰冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直 接变为气体。通过该法所得产品能保持生物大分子的天然 性质，还具有疏松，易于溶解的特性，便于保存应用。
因为生物大分子通常遇热不稳定，极易变性，浓缩和干燥生物大分子 不能用加热蒸发的方法。因此减压浓缩和冷冻干燥已成为生物大分子 制备过程常用的浓缩干燥技术。
溶胀和自溶
溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中， 由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的 现象。
自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用， 发生溶解的现象。
化学处理：用脂溶性的溶剂（如丙酮等）或表面活性剂（SDS）处
理细胞时，可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放 出各种酶类物质，并导致整个细胞破碎。
生物大分子物质的制备
❖ 生物大分子的制备
生物大分子的制备过程包括选材、细胞破碎和细胞器 分离、生物大分子提取纯化、以及样品浓缩干燥和储 存等。
1. 生物材料的选择 2. 细胞的破碎 3. 生物分子的抽提 4. 生物分子的浓缩 5. 有效成分纯度和性质分析
生物大分子物质的制备
❖ 生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢 时产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。
提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小 ；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作 安全等。
❖ 抽提的影响因子：
pH —— 溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的
物质都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。
溶剂极性与离子强度 水解酶 —— 有效成分易遭水解酶破坏 温度 —— 一般酶或蛋白在低温（0℃）时最稳定。 搅拌 —— 搅拌可促使抽提物与抽提液的相互接触，并增加
❖ 吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水， 提取液的体积可缩小三倍左右。若凝胶对有效成分的吸附 能力强，或影响其性质，则不宜采取此法。
❖ 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力 下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。
生物大分子物质的制备
4. 生物分子的浓缩
❖ 透析浓缩法：透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半 透膜而进行纯化的一种方法。
功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生 命的本质和奥秘：运动、神经、内分泌、生长、发育 、繁殖等的分子机理 。
生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
观察：生命现象
分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物 。 （抽提、过滤、离心、色谱）
分析：
结构与性质（序列分析，X-射线晶体衍射，核磁共 振，波谱，质谱等）