第1章 第2节 第1课时 微生物的基本培养技术 讲义【新教材】人教版(2019)高中生物选择性必修3

第2节微生物的培养技术及应用
第1课时微生物的基本培养技术
课标内容要求核心素养对接
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的
微生物培养物的前提。

2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。

3．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室进行微生物分离和纯化的常用方法。

1.科学思维：根据微生物的代谢类型分析培养基的组成。

2．科学探究：讨论并掌握无菌技术的实验操作方法；讨论并掌握微生物的纯培养的方法。

一、培养基的配制
1．培养基
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

2．培养基的种类
3．培养基的营养组成
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。

二、无菌技术
1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。

2．消毒和灭菌
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。

(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。

三、微生物的纯培养
1．纯培养：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。

由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。

2．微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。

3．酵母菌的纯培养
(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。

(2)获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。

判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。

(×)
提示：液体培养基和固体培养基都含有水，它们的区别为是否含有凝固剂。

2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。

(√) 3．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。

(×)
提示：用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行灭菌。

4．培养基分装到培养皿后进行灭菌。

(×)
提示：培养基分装到培养皿之前要进行灭菌。

5．平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。

(√) 6．转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。

(√)
制备培养基
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。

(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。

(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用K2HPO4－KH2PO4。

2．培养基的成分及功能
营养
物质
作用功能主要来源
碳源能为微生物代
谢提供碳元素
构成生物体的细胞物质和一
些代谢产物，有些是异养生
物的能源物质
无机碳源：CO2、
NaHCO3等；有机碳
源：糖类、脂质、蛋
白质、有机酸等
氮源能为微生物的
代谢提供氮元
素
合成蛋白质、核酸以及含氮
的代谢产物
无机化合物：N2、
NH3、铵盐、硝酸盐等；
有机氮源：尿素、牛
肉膏、蛋白胨等
水是生命活动所
必需的
不仅是优良的溶剂，而且可
维持生物大分子结构的稳定
外界摄入
无机盐为微生物提供
除碳、氮以外的
各种重要元素，
包括大量元素
细胞内的组成成分，生理调
节物质，某些化能自养菌的
能源，酶的激活剂
无机化合物
合作探究：(1)能够利用无机碳源的微生物的同化作用类型是什么？
提示：能利用无机碳源的微生物的同化作用类型是自养型微生物。

(2)牛肉膏蛋白胨培养基是一种常见的细菌培养基，其中牛肉膏、蛋白胨能
够提供哪些营养成分？
提示：牛肉膏、蛋白胨能够提供碳源、氮源、维生素(生长因子)和无机盐。

(3)在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是什么？在实验室中培养微生物应注意哪些问题？
提示：在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。

在实验室中培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面确保其他微生物无法混入。

1．下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是()
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
D．待培养基冷却凝固后将平板倒过来放置
A[制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，其顺序不能颠倒，A错误；牛肉膏比较黏稠，所以称好后需将称量纸一同放入烧杯中加热，当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸，B正确；待培养基冷却至50 ℃左右，开始倒平板，C正确；培养基冷却凝固后需将平板倒置，D正确。

]
2．回答下列与细菌培养相关的问题。

(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。

通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________。

硝化细菌在没有碳源的培养基上__________(填“能够”或“不能”)生长，原因是________________。

(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。

(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是___________________________。

(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀
死丢弃物中所有的微生物。

[解析](1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。

不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。

硝化细菌是化能自养型细菌，可以空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。

(2)用平板培养细菌
时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基。

(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。

(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。

[答案](1)蛋白胨不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同能够硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源(2)倒置(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征(4)灭菌
消毒和灭菌
消毒灭菌
概念使用较为温和的物理、化学或生物等
方法杀死物体表面或内部一部分微生
物(不包括芽孢和孢子)
使用强烈的理化方法杀死物体内
外所有的微生物(包括芽孢和孢
子)
常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物
消毒法、紫外线消毒法
灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌
适用操作空间、某些液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培
对象养基等
常用灭菌和消毒方法的比较常用灭菌与消毒方法的比较
灭菌和消毒的种类主要方法应用范围
灭菌湿热灭菌(高压
蒸汽灭菌法）
100 kPa、121 ℃维持
15～30 min
培养基及多种器材、物品干热灭菌
干热灭菌箱160～170 ℃
加热2～3 h
玻璃器皿(如吸管、培养皿
等)、金属用具等凡不适宜用
其他方法灭菌而又能耐高温
的物品
灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具，如接种环、
接种针或其他金属用具等，
接种过程中的试管口或瓶口
等
消毒
煮沸消毒法100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法
62～65 ℃煮30 min或
80～90 ℃煮30 s～1 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等
不宜进行高温灭菌的液体紫外线消毒30 W紫外灯照射30 min 接种室空气
化学药物消毒
用体积分数为70%～
75%的乙醇、碘酒涂抹，
来苏尔喷洒等
皮肤、伤口、动植物组织表
面和空气、手术器械、塑料
或玻璃器皿等
合作探究：1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染
外，还有什么目的？
提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。

2．对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？
提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。

3．用于生物消毒的微生物具有什么特点？
提示：用于生物消毒的微生物能产生杀死其他微生物的代谢产物或是寄生性的微生物。

1．下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是()
A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．灭菌和消毒实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
B[灭菌与消毒的实质是不同的。

灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子，使用的是较为强烈的理化因素，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等，根据不同的材料选用不同的灭菌方法，如接种环的灭菌用灼烧法；消毒是指杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，使用的是较为温和的物理或化学方法。

]
2．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。

请回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_______________________________。

(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________。

在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。

(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。

(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有
达到相应温度，最可能的原因是____________________。

[解析](1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。

(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA 分子。

在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。

(4)自来水通常是采用氯气进行消毒的。

(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。

[答案](1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽
(1)酒精消毒液中酒精浓度对效果的影响：70%的酒精杀菌效果最好。

原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。

(2)无菌技术措施的选择原则。

①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。

②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。

微生物的纯培养
1．平板划线法
平板划线操作及培养结果：接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。

平板划线示意图(A)及培养后菌落分布示意图(B)如下图所示。

2．稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列稀释和涂布平板。

(2)系列稀释和涂布平板后培养结果如图所示：
3．平板划线法与稀释涂布平板法的注意事项
(1)平板划线法：
①接种环的灼烧：
a．第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。

b．每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。

c．划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。

②灼烧接种之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种。

③划线时最后一区域不要与第一区域相连。

④划线用力要大小适当，防止用力过大划破培养基。

(2)稀释涂布平板法：
①稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。

②涂布平板时：
a．涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴
尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

b．不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

c．酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。

4．两种纯化细菌方法的比较
项目优点缺点
平板划线法可以观察菌落特征，对混合
菌进行分离
不能计数
稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特
征
吸收量较小，较麻烦，平板
不干燥效果不好，容易蔓延
合作探究：(1)倒平板时，培养基冷凝后，为什么要将平板倒置？
提示：培养基冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。

(2)接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？
提示：划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。

划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。

(3)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。

如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。

若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。

1．下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是()
A．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B．步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
D．划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
B[由图可知，①是倒平板，②是用接种环蘸取菌液，③是进行平板划线，④是培养。

①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A正确；倒完平板后应立即盖上培养皿，冷却后将平板倒过来放置，B错误；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C正确；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，可以避免培养基中的水分过快地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D正确。

]
2．下图甲、乙是微生物接种常用的两种方式，回答相关问题：
(1)图甲是利用________法进行微生物接种的，图乙是利用_______________法进行微生物接种的。

这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。

(2)平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从________________开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线________。

(3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？___________________。

(4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是__________(填“图甲”或
“图乙”)所示方法。

(5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？________________________________。

[解析](1)图甲和图乙分别是利用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物接种的，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。

(2)平板划线时，每次划线前都要从上一次划线的末端开始，最后一次划线不能与第一次划线相连。

(3)在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。

(4)培养基上的菌落分布均匀，接种方法为稀释涂布平板法。

(5)采用稀释涂布平板法进行菌种分离时，稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。

[答案](1)平板划线稀释涂布平板接种环涂布器灼烧灭菌(2)上一次划线的末端相连(或相接、相交、交叉等)(3)酒精灯火焰附近存在着无菌区域(4)图乙(5)稀释倍数不够，菌液的浓度太高
单细胞菌落的获得
(1)利用平板划线法接种时，单细胞菌落从后划线的区域挑取。

(2)利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落。

[课堂小结]
知识网络构建核心语句背诵
1.各种培养基都含有水、碳源、氮源和
无机盐等营养物质。

2.获得纯净微生物培养物的关键是防
止杂菌污染。

3.消毒是指使用较为温和的物理、化学
或生物等方法杀死物体表面或内部一
部分微生物。

4.灭菌是指使用强烈的理化方法杀死
物体内外所有的微生物，包括芽孢和
孢子。

5.由单一个体繁殖所获得的微生物群
体称为纯培养物，获得纯培养物的过
程就是纯培养。

6.菌落是分散的微生物在适宜的固体
培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼
可见的、有一定形态结构的子细胞群
体。

1．不同培养基的具体配方不同，但一般都含()
A．碳源、磷酸盐和维生素
B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐
D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素
C[培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还应考虑pH、特殊营养物质及O2等条件。

]
2．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌()
A．接种环、吸管、培养基、接种室
B．吸管、接种环、培养基、接种箱
C．培养基、吸管、接种环、接种箱
D．培养皿、吸管、培养基、双手
B[干热灭菌是将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下加热2～3 h，适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；灼烧灭菌是利用酒精灯火焰的充分燃烧层灭菌，如接种针、接种环等；高压蒸汽灭菌用高压蒸汽灭菌锅，一般在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，
维持15～30 min，主要用于培养基灭菌；紫外线照射适用于物体表面灭菌和空气灭菌，如接种室、接种箱、超净工作台等，使用前用紫外线照射约30 min。

] 3．下列有关平板划线操作的描述，错误的是()
A．将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红
B．接种环在平板上划线的位置是随机的
C．在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰
D．最后一区的划线不能与第一区相连
B[接种环在平板上划线的位置并不是随机的：将蘸有菌种的接种环伸入平板内，划三至五条平行线后应盖上皿盖，并灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线，重复以上操作，在三、四、五区域内划线。

] 4．下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是()
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养基被污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
A[接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A错误；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B正确；接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C正确；分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D正确。

故选A。

]
5．下表是培养某微生物的培养基的配方，请回答下列问题：
盐。

上述培养基配方中能充当碳源的成分是____________________。

培养基配制
完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行________处理。

(2)在配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑________、________和渗透压等条件。

(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需进行清洗和________；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质________，还能损伤DNA的结构。

(4)分离纯化微生物最常使用的接种方法是_____________和____________。

(5)在接种前需要检测培养基是否被污染。

对于固体培养基应采用的检测方法是____________________________________________。

[解析](1)培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。

培养基配制完成后要调pH和灭菌。

牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。

(2)配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。

(3)灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，所以要对培养基和培养皿进行灭菌。

消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，故操作者的双手需要进行清洗和消毒。

紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。

(4)分离纯化微生物常采用平板划线法和稀释涂布平板法。

(5)培养微生物时，在接种前需要检测培养基是否被污染。

对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。

[答案](1)氮源牛肉膏和蛋白胨灭菌(2)温度酸碱度(3)灭菌消毒变性(4)平板划线法稀释涂布平板法(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。