最新 染色体转移技术

五、哺乳类人工染色体
ARS：autonomously replicating sequence
YAC克隆系统的特点:
YAC作为可提供大片段DNA的方法，简 化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整 基因的过程（200～500kb，甚至1000kb） 用酵母为宿主重新构建大的人类基因 区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的 YAC。 酵母作为一种真核生物，为其它真核 的DNA提供了更合适的环境。
活性染色质作为基因载体的特点
染色质工程能选择性的转移基因， 并可在不知道目的基因序列或其探针的 情况下进行。且可获得一个复杂系统的 全部活性基因，可对所有活性基因进行 克隆（如YAC克隆，λ克隆等）。
活性染色质作为基因载体的鉴定
基因的鉴定： • 用已知基因的染色质片段进行共制备 • 用所得的活性染色质DNA与家蚕染色质进
• 选择标志基因Cmr 氯霉素抗性基因 • lacZ基因 颜色鉴别重组子，外源基因插入其中 • loxP和cosN位点 易于克隆环状BAC DNA的分离 2.环状BAC DNA经酶切（HindIII）线性化 3.去磷酸化反应 • 高分子量基因组DNA的制备 1.大分子量HindIII酶切片段的制备 2.脉冲电泳选择酶切片段 • BAC克隆及其鉴定 • 电激转化
• F因子又称致育因子，是一个100kb的 质粒，能整合到宿主染色体中，并能高 频率的转移遗传标记。因低拷贝特性使 其重排和嵌合程度低。且F因子呈闭环 结构，可以用常规技术从大肠杆菌中分 离。
1、BAC载体的结构
新一代BAC载体为7.4kb的还状质粒，主要 结构有： • F因子的parA，parB，parC基因 保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂 时均匀分配到子代细胞。 • 起始oriS基因， 严密控制，决定低拷贝和起始 • 解旋酶基因－repC， 易于DNA复制和决定复制方向
三、人工染色体
• 现正在研究的人工染色体有： *酵母人工染色体（YAC，1000kb） *细菌人工染色体（BAC，300kb） *哺乳类人工染色体（MAC） P1派生人工染色体（PAC ） 人类游离人工染色体（HAEC）。
原理
天然染色体基本功能单位包括： 复制起始点，保证了染色体复制； 着丝粒保证了染色体分离； 端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断 裂端，保证了染色体的稳定存在。 人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外 重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并 将它们连接起来，从而构成了人工染色体。相 比于其他复制子而言，染色体要大得多。
YAC载体基本序列元件：
• 酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）：
负责DNA复制
• 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）： 保证酵母细胞分裂时染色体的分配
• 酵母染色体的端粒顺序（TEL）：
维持染色体结构的稳定性（两端各一个） • 选择标记：用于重组克隆的筛选 pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有 Amp大肠杆菌筛选标记
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2、染色体转移技术
微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项利 用微细胞将外源染色体转入受体细胞的技术。该技术 是在细胞融合的基础之上发展起来的，是细胞融合技 术的进一步细化，在当代生物的若干领域里得到广泛 的应用。一些肿瘤抑制基因、端粒酶抑制基因、诱导 衰老基因以及DNA修复基因都是通过MMCT技术取得 细胞内识别和定位，由此促进了针对这些基因的功能 研究，并为相关疾病的治疗提供了依据。同时， MMCT技术也为其他领域如表观遗传学、基因组印迹、 哺乳动物人工染色体等方面的进一步研究提供了有力 的手段。
四、细菌人工染色体（BAC）
• 1992年Shizuya利用F因子的复制点和氯霉 素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131） 基础上构建了第一代BAC人工染色体。
• BAC是以大肠杆菌的F因子的重要位点及
基因为主体的高容量的人工载体。（可克 隆350kb，在重组缺陷型（REC—）宿主 菌只有1个拷贝）
人工染色体 酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（BAC） 哺乳类人工染色体（MAC）
天然染色体片段
• 染色体是基因的天然载体。这个载体上，目的 基因与他两侧的基因或序列是天然的遗传连锁， 这种天然的片段进入受体细胞后，可以长时间 存在，对目的基因有强大的保护作用。
• 提高染色体工程的关键技术是把着丝点分离与 克隆、然后与目的基因重组，并与组蛋白合成 一个染色体片段。
YAC的主要用途是：
(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技
术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基
因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内 表达，并有利于基因保持其固有的空间构象 和功能的发挥。
YAC的缺点：
• 1.插入片段大，稳定性较差，不易子结构往往发生序列重排，造成 序列错乱。
酵母人工染色体（YAC） 是人工染色体中能克隆最大DNA片段的 载体，可以插入 100-2000kb的外源DNA片 段。 YAC是有酵母的自主复制序列、着丝点、 四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵 母线性克隆载体。左臂含有端粒、酵母筛选 标记Trp1、自主复制序列ARS和着丝粒，右 臂含有酵母筛选标记Ura3和端粒，然后在两 臂之间插入大片段DNA构成的。
活性模板染色质—在生命活动的一定时空，只 有一定数量的基因表达，这些正在表达的基因 在染色质中的区域 活性基因—这些正在表达的基因
如果从一定组织提取活性染色质，就会得到 该组织的全部基因，包括细胞中转录极少次数 的基因。
所以，对于真核生物来说，与DNA相比染色 质片段是一种更为天然和更为稳定的转基因载 体。
《 染 色 体 工 程 》
什么是染色体工程？
染色体工程（chromosome engineering）
是人们按照一定的设计，有计划地消 减、添加或代换同种或异种染色体，从而 达到定向改变遗传特性和选育新品种的一 种技术。广义上讲它还应包括染色体内部 的部分遗传操作技术，因此也称为染色体 操作。
染色体工程包括植物染色体工程、 动物染色体工程、人工染色体。
从两个层面展开:
1、从细胞水平诱发染色体数目的改变
2、从染色体水平针对染色体本身操作
目前对染色体操作的主要方法有： 有性杂交、染色体交换、易位、 添加、染色体显微切割和微克隆、 PCR扩增等。
染色体工程的发展经历
• 天然染色体片段（如染色体介导的基因转移） • 天然染色质片段（如染色质介导的基因转移） • DNA重组技术产物-人工染色体
行染色体原位杂交
三、人工染色体
• 染色体作为基因转移的天然载体，可转 移连锁的基因群，故在此基础上发展了 人工染色体。 • 人工染色体（artificial chromosome） 指人工构建的含有天然染色体基本功能 单位的载体系统。 • 人工染色体为基因组图谱制作、基因分 离以及基因组序列分析提供了有用的工 具。
染色体介导的基因转移(CMGT)可把一些紧密连 锁的基因从一个细胞转移至另一细胞。当把分离到的 中期染色体同完整细胞混合时，供体染色体的一部分 可被某些细胞摄取并加以表达。如果受体细胞缺乏该 染色体所携带的功能性基因，而后者又是该细胞在选 择性条件下生存所必需的，转移就可得到证实。因此， 在选择性条件下生存的基因转移克隆，其核内一定有 必需的供体基因参入，而且必须能表达其基因产物。 被转移的染色体物质称为转移基因组 （transgenome），而表达这些基因的细胞则称之 为转化株（transformant）。
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YAC构建示意图
YAC克隆技术简介
• • • • • • • • 完整的染色体DNA的提取 基因组DNA酶切大片段的获取 YAC载体臂的制备 YAC臂与目的DNA大片段的连接 YAC基因库的保存 YAC基因库的鉴定 目的基因YAC克隆的筛选 目的基因YAC克隆的鉴定
YAC的主要用途是： (1)YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。
它不仅可容纳大片段途是：
(2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物 基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目 前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的 技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类 等动物中得到广泛应用，相比于早期的DNA片 段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载 体。
非选择性分离培养基（ non-selective isolation medium）：对微生物没有选择性抑制的分离培养 基，营养成分齐全，无抑制成分（如牛肉膏蛋白胨 培养基）。
选择培养基：是指通过培养混合的微生物，仅得到 或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这 种培养基上是不能生存的。 鉴别培养基：是通过化学试剂显示出培养基上混合 生长的微生物中有某种微生物。
3、被转移染色体片段的大小
大约15％的染色体受体细胞，在光学 显微镜下可见到各种大小的染色体片段。 光学显微镜下见到的最小染色体片段是双 微体（1000kb）。
*双微体（doubleminutechromosomes，DMs） 是基因扩增的主要细胞遗传学标志，是 染色体外遗传单位的一种主要存在形式。 大量研究表明，双微体与基因组不稳定、 恶性肿瘤、细胞耐药及衰老密切相关。
1、染色体的分离技术
染色体分离技术是指通过流式分拣仪分离 染色体或者在显微镜下对特定染色体或染色体 的特定区段进行分离，随后进行DNA体外直接 酶切后克隆或者扩增（PCR）后克隆，以。其优 点是能够根据研究者的需要分离任意一条染色 体或染色体得成功 。
1、染色体的分离技术
• • • • • 哺乳动物细胞培养 秋水仙碱处理细胞使其处于分裂中期 低渗处理，加皂苷，破裂细胞 TMS液处理，离心，收集染色体 染色体储存于含20％甘油的TM液中
TMS缓冲液：含0.05M Tris，3M MgCl2，0.2M蔗糖，pH：7.4 秋水仙素可与微管蛋白二聚体结合，阻止微管蛋白转换，抑制有丝分裂，能 破坏纺锤体，使细胞停止于有丝分裂中期，从而导致细胞死亡 。 皂苷有使红细胞破裂的作用，称溶血性 。
染色体介导的基因转移的主要作用
• 一是用于染色体内的基因作图 • 二是用于分离或克隆一些特殊的基因 • 虽然DNA序列分析技术和基因克隆技术高度 发展的后基因组时代以上用途显得无用，但 染色体片段作为真核细胞基因的天然载体， 仍是诱人的课题。
二、染色质介导的基因转移
• 染色质作为转基因载体的提出 • 染色体介导基因转移由于不能控制所转基因的 染色体或染色体片段的种类、数目和大小，故 不能有选择的转移目的基因。 • 1986年李振刚等提出了以染色质为介导的基因 转移的工作。用活性模板染色质来转移预期基 因（基因群），从而弥补了基因工程的不足。 • 与DNA相比，染色质是一种更为天然和稳定的 转基因载体，便于整合，是基因打靶的理想载 体。
2、染色体转移技术
• 染色体悬液与受体细胞混合
• 生长于非选择培养基中持续3代，加多聚L 鸟氨酸可提高染色体进入受体细胞的几率 • 约3天后移入选择培养基 • 筛选与鉴定
*多聚L鸟氨酸可以改变本来都带负电荷的原生质体或外源 DNA表面电性 ,使其中之一带正电荷 ,从而达到原生质体和 外源 DNA正负相吸 ,并且促进外源DNA进入到原生质体中 。
一、染色体介导的基因转移
• McBride和Ozer第一次令人信服地证明纯化 的染色体片段是对真核细胞进行基因转移的 理想的和天然的载体。 • 受体细胞通常缺乏某一基因的正常功能 • 供体细胞的同源染色体则具有该基因的正常 功能 • 已使用的基因有：HPRT、嘧啶激酶基因、 乳糖激酶基因、抗甲氨蝶呤（MTX）基因、 抗鹅膏覃碱基因