海洋细菌pseudomonassp.qdaalgl、algg基因的研究

海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＱＤＡａｌｇＬ、ａｌｇＧ基因的研究
１／５０ＬＢ稀释至ｏＤｗ＝ｏ．１；取１００ｕＬ稀释液加入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，３７＂Ｃ静置２４小时；加水２００ｕＬ冲洗，水吸干后加入１５０ｕＬ１％结晶紫，室温放置３０分钟染色；加水冲洗至水澄清无色；将水除净，加入２００ｕＬ３３％醋酸溶液溶解，测０Ｄ％
３实验结果
３．１重组质粒ｐＭＦ３６－Ｋａ、ｐＭＦ３６－Ｋａ—ａｌｇＬ的构建
本实验采用的材料是能够生产褐藻胶的假单胞菌Ｐｓｅｕｄｏ四ｏｎａｓｓｐ．ＯＤＡ。

实验目的是通过过量表达ａｌｇＬ基因来改变ＯＤＡ中褐藻胶的聚合度，获得系列的寡糖。

ＱＤＡ菌株具有氨卞青霉素抗性，无卡那抗性，因此转化外源质粒时，选用卡那抗性基因来筛选阳性克隆。

本实验所用表达载体ｐＭＦ３６含有Ｐｔｒｃ强启动子，以及ｒｒｎＢ强终止子，能够高效的表达外源基因。

同时，该质粒具有能够在Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ中稳定复制的ＣｏｌＥｌ，因此可以在Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ细菌体内进行稳定表达。

实验中，首先将ｐ１师＇３６中插入了１．３ｋｂ的卡那抗性基因如图２－２所示，构建了ｐＭＦ３６－Ｋａ（１０ｋｂ），如图２—３所示。

以利于重组质粒的筛选，同时用于空白对照。

通过ＰｅＲ获得了１．１ｋｂ的ａｌｇＬ基因，如图２—４所示。

然后将ａｌｇＬ片段插入ｐｂｉＦ３６－Ｋａ，构建用于过量表达ａｌｇＬ基因的重组质粒ｐｉＦ３６－Ｋａ－ａｌｇＬ，如图２－５所示，大小为１１．１ｋｂ。

图２－２１【ａ基因的ＰｅＲ产物
ｈ
Ｆｉｇ２－２ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆ
海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．０３ＡａｌｇＬ、ａｌｇＧ基因的研究
图２－３质粒ｐ＾伍３６－Ｋａ单酶切图谱
Ｆｉｇ２－３ｌＩａｐｏｆｐＭＦ３６－Ｋａ
图２—４ａｌｇＬ基因的ＰｃＲ产物
Ｆｉｇ２－４ＰａｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆａｌｇＬ图２－５质粒灿仍涨州一单酶切图谱Ｆｉｇ２－５Ｍ８ｐｏｆｐＭＦ３６－Ｋａ－ａｌｇＬ３．２ａ，班基因的诱导表达
电击转化假单胞菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＱＤＡ后，通过氨苄青霉素和卡那霉素双抗筛选，获得阳性克隆。

用卡那霉素抗性基因的引物Ｋａｌ／２进行菌液ＰｃＲ验证，如图２－５所示，表明在ＱＤＡ菌株内已经转入了重组表达载／体ｐＭＦ３６－Ｋａ－ａｌｇＬ，空白对照ＱＤＡ中无目的带。

利用１删的ＩＦｒＧ诱导后，通过ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ电泳发现，含有表达载体的菌株诱导后鲥“基因的表达量显著增加，产生了大量的蛋白
ＡｌｇＬ，其分子量为４１Ｋｄａ，如图争６所示。

ｌ２ｍ
图２－５ｌ【ａｌ／２引物验证重组载体在愚日砌ｍｍ∞中的存在
１，帆；２，转Ａ．ｐＭＦ３６－Ｋａ－ａＩｇＬ的ＱＤＡ；３，ｍａｒｋ盯ＤＬ２０００
Ｆｉｇ２－５Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆｌ【ａｇｅｎｅ．
１，ｑＤ舭２，ＱＤＡｗｉｒｅｐＭＦ３６－Ｋａ－ａｌｇＬ：３·ｍａｒｋｅｒＤＬ２０００
图２—６菌体总蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶电泳图。

１．ＱＤＡ（ｐＭＦ－３６ａｔｇＬ．－Ｋａ），ｌｍＭｍｌｂ诱导；２．ＱＤＡ（ｐＭＦ－３６ａｌｇＬ－Ｋａ），０ｍＭＷＴ６；３．ＱＤＡ；４．
Ｆｉｇ２－６ＳＤＳ—ＰＡＧＥｏｆＡＩ吐
Ｉ，ＱＤＡ（ｐＭＦ－３６ａｌｇＬ－ＫａＸｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｍＭｎ”ｌ－Ｇ）；２．ＱＤＡ（ｐＭＦ－３６ａｌｇＬ－Ｋａ）ｗｉｔｈｏｕｔ
３．３胞外褐藻胶分析
硫酸咔唑法测定褐藻胶标准品的标准曲线为Ｙ＝０．００２８Ｘ＋０．０１１９
（Ｒ＝００．９９９８），如图２—７所示。

其中，横坐标为标准品浓度，纵坐标为在５３０ｎｍ处的吸光值。

Ａｂｓ５３０ｎｍ
图２－７褐藻胶标准品硫酸咔唑法标准曲线
Ｆｉ９２－７ＳｔａｎｄａｒｄｃＩ腑ｏｆａｇｍｍｉｎＳｕｌｆａｍＣａｂ翻Ｉｚｏｌ
利用硫酸咔唑法对不同菌株进行胞外褐藻胶含量分析，根据标准曲线计算出胞外褐藻胶产量的数值。

如表２－２所示。

ＱＤＡ、与转入阚甜ａ、
ｐＭＦ３６－Ｋａ－ａｌｇＬ质粒的ＱＤＡ的胞外褐藻胶产量基本一致．灿吐的过量表达对于ＱＤＡ胞外褐藻胶的产量是没有影响的。

表２－２胞外褐藻胶产量
Ｔａｂｌｅ２＿２Ｑｕａｌｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌａｌｇｉｎａｔｅ
褐藻肢裂解酶基因越业的过量表达，造成了细菌产生的胞外褐藻胶的聚合度发生了变化，ＰＡＧＥｆｆｇ泳显示产物不再是大分子多糖，而是被降解的聚合度分布范围较广的褐藻低聚糖，如图２—８所示．
ｌ２
图２－８细菌产生胞外褐藻胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳
１，ＱＤＡ．２，８１９Ｌ过量表达的ＯＤＡ
Ｆｉｇ２－８ＰＡＧＥｏｆａｌｇｉｎａｔｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉａ．
１，∞Ａ．２，ＱＤＡｗｉｔｈｐ蛆；３６－Ｋａ－ａｌｇＬ
３．４ｓ／ｇＬ基因的过量表达对菌体抗生素敏感性的影响
很多合成褐藻胶的细菌由于胞外产生许多黏性多糖褐藻胶，利于黏附在固体表面形成生物膜，使抗生素等药物大分子难以穿过杀死或抑制细菌。

当褐藻胶裂解酶基因ａｌｇＬ在细菌体内被诱导进行过量表达时，产生了更多的褐藻胶裂解酶，使细菌合成的褐藻胶成为聚合度较低的褐藻胶以及褐藻寡糖，降低了褐藻胶的黏性，从而影响了细菌生物膜的形成以及结构，使部分抗生素易于穿过细菌胞外的保护层而杀死细菌。

实验中发现，ＱＤＡ菌株与褐藻胶裂解酶基因ａｌｇＬ过量表达的ＱＤＡ菌株在生长２４小时后，具有不同抗生素敏感性。

如图２－９所示。

ａｌｇＬ过量表达的菌株产生了更大的抑菌圈，抗生素敏感性增强。

转入ｐＭＦ３６－Ｋａ质粒的ＱＤＡ菌株产生与ＱＤＡ一致的结果（结果未显示）．本实验作用效果显著的都是氨基糖苷类药物。

具体作用机理有待于进一步研究。

实验结果说明，褐藻胶多糖在细菌对抗生素的抗性作用中起到一定作用，褐藻胶的聚合度降低，细菌对某些抗生素的抗性降低，敏感性增加。

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海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ印．ＯＤＡａｌｇＬ、ａｌｇＧ基因的研究
ＡＢ
图２－９过量表达“础基因菌株与原始菌株的抗生素敏感性实验
＾，ＱＤＡ；Ｂ，ａＩＫＬ过量表达的ＱＤＡ
Ｆｉｇ２－９Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｎｂｉｂｉｏｔｉｃｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａ
ｋＱＩ）ＡｓＢ，ＱｇＡｗｉｔｈ８ｉ西ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ
３．５细菌生物膜分析结果
生物膜形成的早期主要是细菌的粘附，结晶紫染色法通过比较细菌贴壁数量，从而反映其生物膜形成能力的不同。

实验中发现，原始菌ＱＤＡ与ａｌＫＬ过量表达的ＯＤＡ表现出了不同的粘附能力，如表２—３所示，在造膜２４小时后，三种菌株结晶紫染色后在５９５ｒ皿处的吸收值有所不同，而含有对照质粒ｐＭＦ３６－Ｋａ的ＱＤＡ表现处与原始菌ＱＤＡ相似的性质。

说明由于ａｌｇＬ的过量表达，影响了该菌形成生物膜的能力。

这可能是由于其所产生的褐藻胶不同造成的，因为褐藻胶在细菌生成生物膜的早期粘附中起到关键作用。

表２－３心‘过量表达对细菌生物膜的影响
Ｔａｂｌｅ２－３ｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｆｉｌｍｗｉｔｈｏｖｅｔｅｘｐｒｅ∞ｉｏｎｏｆａｌｅ业
海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＱＤＡａｌｇＬ、ａｌｇＧ基因的研究
２．７苯酚硫酸法对甘露糖醛酸ｃ－５差向异构酶活性的检测
（１）选择聚甘露糖醛酸为底物，配置底物溶液１０ｍｇ／ｍＬ：
（２）取底物１００ｕＬ，酶活反应终浓度为１ｍｇ／ｍＬ（０．１％）；
（３）与２．６中处理过的重组酶ＡＩｇＧ９００ｕＬ反应１８ｈ：
（４）１００℃加热１０分钟，１２０００ｒｐｍ离心２分钟，除去蛋白沉淀取上清液；（５）苯酚硫酸法测定吸光值，酶活空白对照反应时间为０，其他步骤相同。

（６）以公式Ｅ＝（Ａｂｓ后一Ａｂｓ竹）／０．３３３０计算酶活。

２．８序列分析
本实验所用以口基因，测序结果用Ｂｌａｓｔｎ在ＮＣＢＩ数据库中进行搜索，从中检索到与ａｌｇＧ基因的具有相似性的相关序列。

使用ＤＮＡｃｌｕｂ软件由该基因的ＤＮＡ序列推测可能的氨基酸序列，同时用Ｂｉｏｅｄｉｔ等相关的生物信息学软件对其氨基酸序列进行疏水性分析。

３结果
３．１ＰＣＲ扩增目的基因ａＩｇＧ
由０３Ａ基因组ＰＣＲ获得了ａ］ｇＧ基因，大小１５６０ｂｐ．如图４－ｌ所示
图４－ｌ鲥蕊谨西的屯泳图谱．
●…－
每慷：
ｍ＝ｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；Ｏ：’｜ＱＩ）ＡＥ基因组ＰｃＲ产物啦筘ｌｓ６０ｂｐ
Ｆｉｇ４－１ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍａｐｏｆａｌｇＧ
ＬａｎｅＭ’ＤＬ２０００ｍ锄乜ｅｆ：Ｌａｎｅ０，ａｍｐｌｉｃａｆｉｏｎｏｆａｌｓｏ
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３．２Ｔ＿Ａ克隆阳性筛选与鉴定
阳性克隆Ｔ－ａｌｇＧ的质粒ＤＮＡ命名为ｐＢＳＴ－ａｌｇＧ。

筛选时使用ａｌｇＧｕｐ，ａｌｇＧｌｏｗ引物进行菌液ＰＣＲ，结果如图４．２所示：阳性克隆在１５６０ｂｐ出现目的带，与阴性对照ＱＤＡ基因组所出现的目的带大小一致，质粒成功转入Ｅ．ｃｏｌｉＤＩ－１５ｄ，该菌株为阳性克隆。

使用限制性内切酶ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄｌｌＩ双酶切ｐＢｓｒ－ａｌｇＧ，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图４－３所示：电泳检测表明ｐＢＳＴ载体质粒中插入片段大小在１．５６ｋｂ的确孵片段。

图４－２ＰＣＲ鉴定阳性克隆ｐＳＳＴ－ａｌｇＧ
Ｍ：ｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；０．－ＱＤＡ基因组对照；ｌ：阳性克隆ｐＢＳＴ－ａｌｇＧ．－ＤＨＳａ
Ｆｉｇ４－２ＰＣＲｏｆｐａＳＴ－ａｌｇＧ
Ｌ啦ｅＭ，ＤＬ２０００ｍ蛔ＬＲｕｅｏ，ａｍｐｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｉｔｈＱＤＡｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ，Ｌ锄ｅ１，ａｍｐｌｉｅａｆｉｏｎ
ｏｆｗ／ｔｈｐＢＳＴ－ａｌｇＧ－ＤＨ５ａ
图垂－３酶切质粒ｐＢ！ＳＴ－ａｌ蜘的琼脂糖电泳
１１分子置标准ＤＬ２，０００ｓ２：ＮｄｅＩ／ＢｉｎｄｌＩＩ双酶切ｐＢＳＴ－ａｌｇＧ；３＃质粒ｐＢＳＴ－ａｌｇＧ
Ｆｉｇ¨ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｃｓｉｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｐＢＳＴ－ａｌｇＧ
ｔｕｒｋｓ，Ｌａｎｅ２，ｐｌａｓｍｉｄｐＢＳＴ－ａｌｇＧｄｉｇｅｓｔｅｄＮｄｅＩａｎｄＨｉｎｄＩＩＩ；Ｌａｎｅ３，Ｌ封博１，ＤＬ２，０００
ｐｌａｓｍｉｄｐＢＳＴ－ａｌｇＧ
海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ￥ｓｐ．如Ａａｌ吐，ａｌｇＧ基因的研究
３．３重组质粒ｐＥＴ２４ａ－ａＩｇＧ的鉴定
筛选重组工程菌时使用ａｉｇＣｍｐ，ａｌｇＧｌｏｗ引物进行菌液ＰＣＲ，结果如图４．４所示：三个克隆均在１５６０ｂｐ出现目的带，这三个克隆均为阳性克隆。

阳性克隆质粒命名为ｐＥＴ２４ａ－ａ１９６。

使用限制性内切酶ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图４—５所示：电泳检测表明Ｌ５６ｋｂ的目的基因ａｌｇＧ插入５．３ｋｂｐＥＴ２４ａ载体中。

图４－４ｐＥＴ２４ａ－ａｌｇＧ－ａＬ２１菌液ＰＣＲ阳性克隆鉴定
Ｍ：ｍａｒｋｅｒＤＬ２０００ＢＩ、Ｂ２、１３３：阳性克隆
Ｆｉｇ４－４ＰＣ＂ＲｏｆｐＥＴ２４ａ－ａｌｇＧ－ＢＬ２］
图４＿５酶切质粒ｐＥＴ２４ａ－ａｌｇＧ的琼脂糖电泳
１１分子量标准ＤＬｌＳ，０００；２，４：阴性对照；３，５＃ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄｌＩＩ双酶切ｐＥＴ２４ａ－ａｌｇＧ；
６：分子量标准ＤＩ．２，０００。

№４－５Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｐｌａｓｍｉｄ
ｐＥＴ２４ａ－ａｌｇ（１
Ｌａｎｅｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｚｍａｒｋｅｒＤＬｌ５，０００；Ｌａｎｅ２ａｎｄ４，ｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ２４ａ－ａｌｇＧ；Ｌａｎｅ３ａｎｄ５。

ｐｌａｓｍｉｄｐＥ＇Ｘ＇２４ａ－峭ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＮｄｅＩａｎｄＨｉｎｃｍＩ；６，ＤＬ２，０００ｍｍｋｅｒ
海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏ∞ｏｎａｓｓｐ．ｑＤＡａｌｇＬ、ａｌｇＧ基因的研究
３．４重组甘露糖醛酸０－５差向异构酶ＡＩｇＧ的诱导表达条件优化本论文使用ｐＥＴ２４ａ系统进行ａｔｇＧ基因的重组表达，该系统使用ＩＰＴＧ作为诱导剂。

由于本表达系统是商品化产品，因此，在本实验中只需要对表达时所用ＩＰＴＧ的剂量这一条件进行优化。

在本实验中，ＩＰＴＧ终浓度为０、０．２、０．４、０．６、０．８和１删的不同诱导表达剂量组，经培养，诱导表达后，进行聚丙烯酰胺（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）凝胶电泳检测Ｃ脯１５；Ｃ％’３；１３０Ｖ．Ａ．ｈ），结果如图４－６。

对电泳结果进行分析，发现：当所用ＩＰＴＧ终浓度达到０．６ｍＭ时，２５０ｃ诱导表达１６ｈ，５７１０）左右的诱导表达产物达到最大表达量，目的产物随不再诱导物剂量的增加而增加。

因此，选定ＩＰＴＧ终浓度为０．６枷的条件作为诱导剂的最佳剂量。

图４－６不同剂量ＩＰＴＧ诱导后的重组菌体蛋白
Ｏ～５泳道样品所用ＩＰＴＧ剂量分别为０、０．２，０．４、０．６、０．８、１枷。

Ｆｉｇ４－６．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｉｇＧｇｅｎｅｖｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔＩＰＴＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
Ｌａｎｅｓ０－５，ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈ０，０．２，０．４’０．６，０．８，１．０埘ＩＦｒＧｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＬａｎｅＭｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ
３．５重组甘露糖醛酸Ｏ－５差向异构酶ＡＩｇＧ的大量表达与纯化培养含有ｐＥＴ２４ａ－ａｌｇＧ重组质粒的重组大肠杆菌５０ｍＬ，至６００ａｍ测定菌种浓度为０．５８时，加入浓度为１Ｍ的ＩＰＴＧ共３０ｕＬ至终浓度为０．６ｍＭ，２５０Ｃ、
海洋细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＱＤＡａｌｇＬ、ａｌｇＧ基因的研究
１２５ｒｐｍ诱导表达１６ｈ，测定０Ｄｍ＝０．９８。

离心收获菌体后，加入１００ｍＭ的ＰＢ缓冲液㈣７．ｏ）５ｍＬ重悬菌体。

超声处理后，离心得到上清液，０．２２ｕＭ滤膜超滤。

各组分分别进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳检测（图４－７），Ｇｅｎｓｙｓｔｅｍ分子成象系统扫描。

图４＿７Ａ１９Ｇ各组分ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ｌ‘蛋白ｍａｒｋｅｒｌ１，菌体蛋白（０埘ＩＰＴＧ）；２，菌体蛋白（１埘ＩＰＴ６）Ｉ３，超声破碎上清；
４，超声破碎沉淀。

Ｆｉｇ４－＇７ＳＤＳ－Ｐ＾ＧＥｏｆＡ１９Ｇ
ｌＩ’ｐｒｏｔｅｉｎｍｕｒｋｅｒ；ｌ，ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ（０删ＩＰＴＧ）；２，ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｏ．６碰ＩＰＴＧ）：３，ｂａｃｔｅｒｉａｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｎｔａｎｔｂｒｏｋｅｎｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗａｖｅ；４，ｂａｃｔｅｒｉａ
ｓｅｄｉｍｅｎｔｂｒｏｋｅｎｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗａｖｅ
３．６甘露糖醛酸ｃ－５差向异构酶活性的初步分析
依据第三章方法对甘露糖醛酸ｃ－５差向异构酶活性进行初步分析。

聚甘露糖醛酸底物终浓度为１ｍｇ／ｍＬ，加入以２．６方法制备的重组甘露糖醛酸ｃ－５差向异构酶，３０＂Ｃ反应１８小时后，以苯酚硫酸法测定样品吸光值即ｈｂｓ量为０．４４６９，空白对照的吸光值即Ａｂｓｔ为０．３３７０，按公式计算Ｅ＝０．３３，即约有３３９６的甘露糖醛酸转变为古罗糖醛酸。

，３．７序列分析结果。