分子生物学实验一植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
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维持合Leabharlann Baidu的pH 具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移
保护DNA不被降解
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
DNA纯化（去杂质）
蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大 分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩 的材料。 多糖 提取液中加1％PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。
材料与试剂
高级分子生物学实验课一
植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
实验要求 • • • • • • 分组实验 仔细观察、认真操作 不大声喧哗 不迟到早退 有事向课代表请假 按时交实验报告
DNA结构
AT G C
DNA存在形式
与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备 核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来
• 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 • 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%)
0.3
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60
0.6
0.7
1～20
0.8～10
0.9
1.2 1.5
0.5～7
0.9～6 0.2～3
12.0
0.1～2
常用电泳缓冲液
Tris-乙酸（TAE） Tris-硼酸（TBE） Tris-磷酸（TPE）
–DNA分子量标准
染色、照相
• 溴化乙啶（EB）
• UV Light
• CCD
作业
• 实验报告
– 目的、材料与方法、结果、讨论
CTAB抽提液作用原理
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇（PVP）是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌， 避免褐变，使酚容易去除
琼脂糖浓度琼脂糖浓度线型线型dnadna分子的分离范围分子的分离范围kbkb03035560600606112020070708081010090905057712120909661515020233120120010122tris乙酸taetris硼酸tbetris磷酸tpe维持合适的ph具有一定的导电性以利于dna分子的迁移保护dna不被降解电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色一般与蔗糖甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液
DNA提取
CTAB法 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十 六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶 解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶 液中（>0.7mol/L NaCl）可溶。通过有机溶剂抽提， 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀 （CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 SDS法 SDS 是有效的阴离子去垢剂 , 细胞中 DNA 与蛋白 质之间常借静电引力或配位键结合 , SDS 能够破坏 这种价键。
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间， 在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含 量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。
其它染料： GeneFinder、Goldview、Genegreen等
实验材料 杨树叶片 试剂 2×CTAB抽提液 氯仿：异戊醇(24:1) 异丙醇 70%乙醇
仪器用具
①微量移液器
②水浴锅
③离心机
④电泳仪及电泳槽
⑤凝胶成像仪
常见问题
常见问题
电泳原理
DNA分子在高于等 电点的PH溶液中带 负电荷，在电场中 向正极移动。在一 定电场强度下， DNA分子的迁移速 度与相对分子质量 的对数成反比。
植物DNA提取流程
– 细胞破碎 • 研磨 – 膜、组蛋白的分离 • CTAB • SDS – DNA纯化 • 蛋白变性 • 去除酚、糖 – DNA的沉淀 • 乙醇 • 异丙醇
细胞破碎
①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；
②化学试剂法：用SDS处理细胞；
③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。
保护DNA不被降解
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
DNA纯化（去杂质）
蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大 分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩 的材料。 多糖 提取液中加1％PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。
材料与试剂
高级分子生物学实验课一
植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
实验要求 • • • • • • 分组实验 仔细观察、认真操作 不大声喧哗 不迟到早退 有事向课代表请假 按时交实验报告
DNA结构
AT G C
DNA存在形式
与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备 核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来
• 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 • 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%)
0.3
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60
0.6
0.7
1～20
0.8～10
0.9
1.2 1.5
0.5～7
0.9～6 0.2～3
12.0
0.1～2
常用电泳缓冲液
Tris-乙酸（TAE） Tris-硼酸（TBE） Tris-磷酸（TPE）
–DNA分子量标准
染色、照相
• 溴化乙啶（EB）
• UV Light
• CCD
作业
• 实验报告
– 目的、材料与方法、结果、讨论
CTAB抽提液作用原理
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇（PVP）是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌， 避免褐变，使酚容易去除
琼脂糖浓度琼脂糖浓度线型线型dnadna分子的分离范围分子的分离范围kbkb03035560600606112020070708081010090905057712120909661515020233120120010122tris乙酸taetris硼酸tbetris磷酸tpe维持合适的ph具有一定的导电性以利于dna分子的迁移保护dna不被降解电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色一般与蔗糖甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液
DNA提取
CTAB法 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十 六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶 解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶 液中（>0.7mol/L NaCl）可溶。通过有机溶剂抽提， 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀 （CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 SDS法 SDS 是有效的阴离子去垢剂 , 细胞中 DNA 与蛋白 质之间常借静电引力或配位键结合 , SDS 能够破坏 这种价键。
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间， 在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含 量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。
其它染料： GeneFinder、Goldview、Genegreen等
实验材料 杨树叶片 试剂 2×CTAB抽提液 氯仿：异戊醇(24:1) 异丙醇 70%乙醇
仪器用具
①微量移液器
②水浴锅
③离心机
④电泳仪及电泳槽
⑤凝胶成像仪
常见问题
常见问题
电泳原理
DNA分子在高于等 电点的PH溶液中带 负电荷，在电场中 向正极移动。在一 定电场强度下， DNA分子的迁移速 度与相对分子质量 的对数成反比。
植物DNA提取流程
– 细胞破碎 • 研磨 – 膜、组蛋白的分离 • CTAB • SDS – DNA纯化 • 蛋白变性 • 去除酚、糖 – DNA的沉淀 • 乙醇 • 异丙醇
细胞破碎
①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；
②化学试剂法：用SDS处理细胞；
③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。