大麦DUF668家族基因鉴定及表达分析

麦类作物学报 2024,44(2):158-168
J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o p
s d o i :10.7606/j
.i s s n .1009-1041.2024.02.03网络出版时间:2023-12-13
网络出版地址:h t t p
s ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1359.s .20231212.1500.010大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析
收稿日期:2023-01-23 修回日期:2023-07-04
基金项目:国家自然科学基金面上项目(32272159);国家重点研发计划项目(2019Y F D 1005002-03-04
)第一作者E -m a i l :799148942@q q .c o m (王月雪)通讯作者E -m a i l :z y
h b o b @163.c o m (赵彦宏)王月雪1,母景娇1,王孜逸2,耿梓瀚1,倪守飞1,刘梦迪1,
蔡倩2,赵彦宏1,王艳芳2
(1.鲁东大学农学院,山东烟台264025;2.鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025
)摘 要:D U F 668家族基因对植物逆境胁迫响应有重要作用㊂为探讨大麦D U F 668家族基因的结构及
表达模式,采用生物信息学的方法对大麦D U F 668基因结构㊁蛋白结构㊁系统进化树㊁共线性及表达模式进行了分析㊂结果显示,供试大麦中共鉴定出9个D U F 668基因,
分布在5条染色体上㊂系统发育进化树将9个D U F 668基因分为三个亚组,第Ⅰ亚组包括H v D U F 668-01㊁H v D U F 668-02和H v D U F 668-09,内含子数量较多,均有11个内含子;第Ⅲ亚组包括H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-05㊁H v D U F 668-07和H v D U F 668-08,内含子数0~3个,其中H v D U F 668-04与H v D U F 668-05没有内含子;第Ⅱ亚组包括H v D U F 668-03和H v D U F 668-06,内含子数量(9和7)介于第Ⅰ亚组和第Ⅲ亚组之间㊂蛋白保守基序分析表明,9个蛋白均含有D U F 668保守结构域的特征序列及D U F 3475保守结构域的特征序列(H v D U F 668-06除外);第Ⅰ亚组蛋白的M o t i f 数量(8~10个)比第Ⅱ㊁Ⅲ亚组(4~6个)多,且包含第Ⅱ㊁Ⅲ亚组中的所有M o t i f ㊂表达谱分析表明,不同D U F 668基因在不同组织和发育时期的表达量存在差异,H v D U F 668-09在颖果中的表达量随着颖果的发育而升高,而H v D U F 668-01和H v D U F 668-02则相反;H v D U F 668-01和H v D U F 668-02在花序中的表达量随着花序的发育而升高㊂q R T -P C R 结果显示,受黄矮病病毒侵染大麦幼苗与未受侵染幼苗相比,H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-05和H v D U F 668-08表达量提高了100~180倍㊂
关键词:大麦;D U F 668家族基因;
生物信息学;逆境胁迫;表达模式分析中图分类号:S 512.3;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2024)02-0158-11
I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nP r o f i l e s o fD U F 668G e n eF a m i l y i nB a r l e y
W A N GY u e x u e 1,M UJ i n g j i a o 1,W A N GZ i y i 2,G E N GZ i h a n 1,N I S h o u f e i 1
,L I U M e n g d i 1,C A I Q i a n 2,Z H A OY a n h o n g 1,W A N GY a n f a n g
2(1.C o l l e g e o fA g r i c u l t u r e ,L u d o n g U n i v e r s i t y ,Y a n t a i ,S h a n d o n g 264025,C h i n a ;2.C o l l e g e o fL i f e s c i e n c e ,L u d o n g U n i v e r s i t y
,Y a n t a i ,S h a n d o n g 2
64025,C h i n a )A b s t r a c t :T h eD U F 668g e n e f a m i l yp l a y sa n i m p o r t a n t r o l e i n p l a n t s t r e s s r e s p
o n s e .I no r d e r t oe x -p l o r e t h e g e n e s t r u c t u r e a n d e x p r e s s i o n p a t t e r no f b a r l e y D U F 668g e n e f a m i l y ,w e a n a l y
z e d t h e g e n e s t r u c t u r e ,p r o t e i n s t r u c t u r e ,p h y l o g e n e t i c t r e e ,c o l l i n e a r i t y a n d e x p r e s s i o n p a t t e r no f b a r l e y D U F 668g e n e f a m i l y b y b
i o i n f o r m a t i c s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t n i n eD U F 668g e n e sw e r e i d e n t i f i e d ,d i s t r i b u -t e do n f i v e c h r o m o s o m e s .T h e n i n eD U F 668g e n e sw e r e d i v i d e d i n t o t h r e e s u b g r o u p s b yp h y l o g
e n e t i c t r e e .S u b g r o u p I
c o n t a i n e
d H v D U F 668-01,H v D U F 668-02a n d H v D U F 668-09w i t h11i n t r o n s ,w h i l
e s u b g r o u p Ⅲc
o n t a i n e d H v D U F 669-04,H v D U F 668-05,H v D U F 668-07a n d H v D U F 668-08,w i t ht h e l e a s t i n t r o n s ,a m o n g w h i c h H v D U F 668-04a n d H v D U F 668-05h a dn o i n t r o n s ;s u b g r o u p Ⅱc
o n t a i n e d H v D U F 668-03a n d H v D U F 668-06,w i t h i n t r o n s b e t w e e n s u b g r o u p Ⅰa n d s u b g r o u p Ⅲ.
P r o t e i n c o n -s e r v e dm o t i f a n a l y s i s s h o w e d t h a t a l l p r o t e i n s c o n t a i n e d t h e c h a r a c t e r i s t i c s e q
u e n c e so fD U F 668c o n -
s e r v e dd o m a i na n dD U F3475c o n s e r v e dd o m a i n(e x c e p t f o rH v D U F668-06).T h en u m b e ro fm o t i f i n s u b g r o u pⅠ(8-10)w a sm o r e t h a n t h a t i n s u b g r o u pⅡa n dⅢ(4-6),a n d t h em o t i f s o f s u b g r o u pⅡa n dⅢw e r e a l s o c o n t a i n e d i n s u b g r o u pⅠ.E x p r e s s i o n p r o f i l e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o no f d i f f e r e n tD U F668g e n e sw a s d i f f e r e n t i nd i f f e r e n t t i s s u e s a n dd e v e l o p m e n t a l s t a g e s.T h e e x p r e s s i o n o f H v D U F668-09i nc a r y o p s i si n c r e a s e d w i t ht h ed e v e l o p m e n to fc a r y o p s i s,w h i l et h ee x p r e s s i o no f H v D U F668-01a n d H v D U F668-02i n c r e a s e d w i t ht h ed e v e l o p m e n to f i n f l o r e s c e n c e.T h er e s u l t so f q R T-P C Rs h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l so f H v D U F668-04,H v D U F668-05a n d H v D U F668-08i n b a r l e y s e e d l i n g s i n f e c t e d b y y e l l o wd w a r f v i r u sw e r e i n c r e a s e d b y100-180t i m e s c o m p a r e dw i t h t h o s e o f s e e d l i n g sw i t h o u t y e l l o wd w a r f v i r u s i n f e c t i o n.
K e y w o r d s:B a r l e y;D U F668g e n e f a m i l y;B i o i n f o r m a t i c s;S t r e s s;E x p r e s s i o n p r o f i l e a n a l y s i s
D U F(d o m a i no fu n k n o w nf u n c t i o n)家族是一大类含有未知功能的超基因家族总称[1-2]㊂随着研究的深入,D U F家族的数量迅速增加,截至2021年,整个家族已扩展至D U F3598[3]㊂大部分D U F基因被认为与非生物胁迫有关[4-9]㊂D U F668是其中一类高度保守的植物特异性的转录因子[10],其特征是包含29个氨基酸的保守结构域,在植物抗逆与抗病的过程中发挥着重要作用[11]㊂该结构域最初在拟南芥中发现,位于拟南芥P S I蛋白的C-末端,P S I蛋白具有促进植物生长的作用[12]㊂Z h o n g等[10]研究了拟南芥和8种禾本科代表作物(103个)的D U F668家族基因,发现其对抗旱和生物防御至关重要㊂Z h a o等[11]研究结果显示,D U F668家族基因可增加棉花抗逆性㊂D U F668家族蛋白的重要特征是其中一个亚组包含A v r9/C f-9;C f-9是一种通过识别A v r 多肽而产生特种抗性的蛋白质,而两者相互识别成为C f/A v r互作体系中的一种[10,13]㊂A v r9/C f-9对病原体入侵的识别被作为分析植物防御反应信号通路的典型模型系统[14]㊂研究显示,A v r9/ C f-9有助于水稻提高对伤口及稻瘟病的防御能力[10],有助于棉花提高抗寒性及抗黄萎病的能力[10-11]㊂
大麦是世界第四大重要的谷物,也是世界上最早驯化作物之一,不仅是重要的粮食和饲料作物,也是有价值的二倍体模式谷物[15]㊂大麦生长发育过程中面临着很多逆境胁迫[15-18]及病虫害[19-21],而有关D U F668家族在大麦中的进化㊁功能和分类尚未得到系统研究㊂本研究拟系统鉴定大麦D U F668家族的成员,并利用生物信息学的方法对鉴定到的成员进行染色体分布㊁基因结构㊁顺式作用元件等分析,以揭示其可能的生物学功能,为大麦抗逆育种提供参考㊂1材料与方法
1.1大麦D U F668家族成员的鉴定及定位
从E n s e m b l P l a n t数据库(h t t p://p l a n t s.e n-s e m b l.o r g/i n d e x.h t m l)和U n i P r o t数据库(h t-t p s://w w w.u n i p r o t.o r g/)中下载大麦蛋白序列㊂从P f a m数据库(h t t p://p f a m.x f a m.o r g/)获取D U F668蛋白特征文件(P F05003)㊂利用HMM E R3软件(h t t p://w w w.h mm e r.o r g/)扫描大麦蛋白序列并预测候选的D U F668蛋白;通过S MA R T软件(h t t p://s m a r t.e m b l-h e i d e l-b e r g.d e/)对候选的D U F668蛋白进行鉴定㊂
从P h y t o z o m e数据库(h t t p s://p h y t o z o m e. j g i.d o e.g o v/p z/p o r t a l.h t m l)获取大麦D U F668基因在染色体上的位置信息,通过MG2C软件(h t t p://m g2c.i a s k.i n/m g2c_v2.1/)绘制染色体位置图;利用C e l l-P l o c2.0(h t t p://w w w.c s b i o. s j t u.e d u.c n/b i o i n f/C e l l-P L o c-2/)进行蛋白亚细胞定位㊂
1.2蛋白结构及基因结构分析
利用P r o t P a r a m(h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/ p r o t p a r a m/)预测蛋白的基本理化性质;通过S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/ n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a_s o p m a.h t m l)预测蛋白的二级结构;使用S W I S S-MO D E L(h t-t p s://s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e)预测蛋白的三级结构;通过T MHMM工具(h t t p s:// s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p?T M-HMM-2.0)预测蛋白跨膜结构域㊂
利用G S D S(h t t p://g s d s.c b i.p k u e d u.c n/)绘制基因结构图;利用M E M E(h t t p://m e m e s u-i t e.o r g/t o o l s/m e m e)绘制蛋白保守基序图(M o-t i f最大数值设定为10),利用G E N E D O C软件进
㊃951㊃
第2期王月雪等:大麦D U F668家族基因鉴定及表达分析
行保守序列分析㊂
1.3顺式作用元件、进化与共线性分析
使用P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a t i c s. p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l/)预测基因启动区域的顺式作用元件并绘制其分布图谱㊂利用M E G A-X软件[22]进行D U F668蛋白的多序列比对,并采用邻接法(N e i g h b o r-j o i n i n g, N J)构建系统发育进化树㊂利用T B t o o l s[23]分别对大麦与玉米㊁大麦与水稻之间的D U F668基因进行共线性分析㊂
1.4大麦D U F668基因在不同组织的表达分析
从E x p r e s s i o nA l t a s数据库(h t t p s://w w w.
e b i.a c.u k/g x a/e x p e r i m e n t s)下载大麦R N A-S e q 转录组数据(E-MT A B-2809),该套数据包含了大麦的根㊁花序1c m㊁花序5c m㊁节间㊁颖果15d㊁颖果5d㊁幼苗和胚芽共8个组织的基因表达信息;从该转录组数据中获取大麦D U F668基因的F P-KM值,并使用T B t o o l s软件绘制大麦D U F668基因的表达热图㊂
1.5大麦D U F668基因在不同胁迫下的表达分析
试验材料为抗大麦黄矮病品种M o r e x和感病品种A t l a s68㊂将大麦M o r e x种子平铺于平板上浸湿的纱布表面,保持纱布湿润,待种子萌发露白后转移至水培盒进行温室培养,温室条件为昼26ħ/夜23ħ,光照周期为16h光照/8h黑暗;用霍格兰营养液配置100μm o l㊃L-1M e J A㊁100μm o l㊃L-1P E G6000,以营养液为对照;将温室培养7d的大麦分别移至750m L上述溶液中,其中营养液培养分为两组,一组暗处理,一组正常温室培养;不同处理12h㊁24h㊁48h后,取幼苗地上部30m g,于-80ħ保存待用㊂每个处理3次重复㊂将大麦A t l a s68种子分两组播种于花盆中,并放置在温室培养,温室条件同上;大麦出苗15d 后,用不少于20只携带黄矮病毒的蚜虫对其中一组幼苗进行侵染,用同样数量的无毒蚜虫接在另一组大麦幼苗上,作为对照组;蚜虫取食2d后灭蚜,灭蚜后第6天取其地上部分叶片30m g,3次重复,并于-80ħ保存备用㊂
用R N Ai s o l a t e rT o t a lR N A E x t r a c t i o nR e-a g e n t(R401-01,诺唯赞)参照使用说明书提取不同处理大麦叶片(-80ħ保存)总R N A㊂使用超微量核酸蛋白测定仪(D e N o v i x,D S-11)测定R N A提取浓度㊂利用试剂盒H i S c r i p tI I1s t S t r a n dc D N A S y n t h e s i s K i t(+g D N A w i p e r)(R212-02,诺唯赞)参照说明书合成c D N A㊂利用P r i m e r3在线软件(h t t p s://p r i m e r3.u t.e e/)设计大麦D U F668基因的q R T-P C R引物,以H v A c t i n基因作为内参,引物由上海生工生物工程有限公司合成㊂使用实时荧光定量试剂盒B i o E a s y M a s t e rM i xS Y B R G r e e n(艾科瑞)参照说明书在A B I7500荧光定量P C R仪中进行基因扩增;扩增条件为95ħ15s,60ħ15s,72ħ30s,39个循环;每个样品3次重复㊂采用2-ΔΔC t 方法计算基因的相对表达量㊂
2结果与分析
2.1大麦D U F668家族成员的鉴定结果及分析
利用HMM E R从大麦中鉴定到9个D U F668基因,其长度为1187~11490b p,对应的C D S长度为888~2007b p;根据其在染色体上的位置分别命名为H v D U F668-01~ H v D U F668-09(表1)㊂9个基因不均匀地分布在大麦的5条染色体上(图1),在C h r5H上最多(4个),在C h r2H和C h r6H上没有检测到;
H v D U F668基因在染色体上分布较为分散,没有成簇分布现象㊂这与水稻和棉花的D U F668基因在染色体上的分布特征类似[10-11]㊂
9个大麦D U F668蛋白质长度为475~680
a a,相对分子量为34.1~74.2k D,等电点(p I)为
7.4~9.0,亲水指数(G R A V Y)均为负数,表明大麦D U F668蛋白均为亲水性碱性蛋白(p I>7),但亲水程度有差异(表2)㊂大部分蛋白的二级结构表现为α-螺旋>无规则卷曲>β-折叠>β-转角,只有H v D U F668-06蛋白的二级结构表现为α-螺旋>无规则卷曲>β-转角>β-折叠;9个蛋白的α-螺旋和无规则卷曲占比之和均大于90%㊂H v D U F668蛋白的三级结构呈现出一定的规律性,同一亚组有较大的相似性,不同亚组间有一定差别(图2)㊂
跨膜结构域预测结果显示,9个H v D U F668蛋白均不含跨膜结构域,暗示H v D U F668蛋白合成后不会经历跨膜运输㊂亚细胞定位预测结果显示,9个蛋白均定位于细胞核中㊂
2.2基因结构及蛋白保守基序分析
根据进化树,9个H v D U F668基因被划分为3个亚组,第Ⅰ亚组包括H v D U F668-01㊁H v D U F-668-02和H v D U F668-09共3个基因,其内含子数量较多,均有11个;第Ⅱ亚组包含H v D U F668-03
㊃061㊃麦类作物学报第44卷
和H v D U F 668-06基因,
分别有9和7个内含子;第Ⅲ亚组包含H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-05㊁H v D U F -
668-07和H v D U F 668-08共4个基因,
内含子数依次为0㊁0㊁2和3
(图3)㊂由此可看出,不同亚组间的H v D U F 668基因内含子数存在明显差异㊂这与棉
花D U F 668家族基因类似[11]
㊂第Ⅰ亚组H v D U F 668
表1 大麦D U F 668基因的染色体定位及序列信息T a b l e 1 C h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o no f b a r l e y D
U F 668g e n e s 基因名
G e n e n a m e
基因I D
G e n e I D
位置
P o s i t i o n
长度
L e n g t h /b p
C D S /b p 亚组
S u b g r o u p
H v D U F 668401H O R V U 1H r 1G 074410C h r 1H :507969852~507980221:+6561938ⅠH v D U F 668-02H O R V U 3H r 1G 082170C h r 3H :598203067~598214558:-6802007ⅠH v D U F 668-03H O R V U 4H r 1G 018430C h r 4H :84574590~84578912:-6751992ⅡH v D U F 668-04H O R V U 4H r 1G 060260C h r 4H :505089218~505091246:-4751404ⅢH v D U F 668-05H O R V U 5H r 1G 041250C h r 5H :311355148~311357153:+5551638ⅢH v D U F 668-06H O R V U 5H r 1G 077430C h r 5H :553244801~553250995:-3021569ⅡH v D U F 668-07H O R V U 5H r 1G 112000C h r 5H :637875117~637876304:+563888
ⅢH v D U F 668-08H O R V U 5H r 1G 124940C h r 5H :667585479~667589994:+4961461ⅢH v D U F 668-09
H O R V U 7H r 1G 116880
C h r 7H :644288248~644294274:+
633
1869Ⅰ
+:前导链;-:滞后链㊂+:L e a d i n g s t r a n d ;-:L a g g i n g s
t r a n d .表2 大麦D U F 668蛋白的基本理化性质
T a b l e 2 S e q u e n c e f e a t u r e s a n d p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h eD U F 668p r o t e i n s i nb a r l e y
蛋白名称
P r o t e i nn a m e
蛋白I D
P r o t e i n I D 长度
L e n g t h /a a 分子量
MW /k D 等电点
P I 亲水指数
G R A V Y α-螺旋α-h e l i x β
-折叠β-s h e e t β
-转角β-a n g l e 卷曲
C o i l
定位
L o c a t i o n H v D U F 668-01
M 0Y V S 1
64572.47.4-0.5250.54.502.842.2N u c l e u s
H v D U F 668-02A 0A 287L Y 8651774.19.2-0.6850.34.792.442.5N u c l e u s H v D U F 668-03A 0A 287N F 5666374.29.3-0.5548.77.394.239.7N u c l e u s H v D U F 668-04
F 2C Z T 1
46751.49.9-0.3362.33.002.432.3N u c l e u s H v D U F 668-05A 0A 287RW 7235959.79.6-0.2656.04.771.737.6N u c l e u s H v D U F 668-06A 0A 287RW 0530234.18.5-0.2968.20.662.728.5N u c l e u s H v D U F 668-07A 0A 287RW 2536461.68.5
-0.2753.87.102.336.8N u c l e u s H v D U F 668-08
M 0X 41251752.110.6-0.2663.26.161.429.2N u c l e u s H v D U F 668-09A 0A 287X X Z 7
622
69.7
8.7-0.70
51.1
4.66
2.3
42.0
N u c l e u
s 图1 大麦H v D U F 668在染色体上的位置
F i g .1 C h r o m o s o m e l o c a t i o n s o f b a r l e y H
v D U F 668g e n s ㊃
161㊃第2期
王月雪等:大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析
图2 9个大麦D U F 668蛋白的三级结构图F i g .2 T e r t i a r y
s t r u c t u r e s o f t h e n i n e D U F 668p r o t e i n s i nb a r l e y
基因较长,其中H v D U F 668-02最长(大于11
k b );第Ⅲ亚组的基因较短,其中H v D U F 668-07最短(介于1k b ~2k b )㊂9个H v D U F 668基因内含子的长度差别较大,第Ⅲ亚组基因的内含子较短㊂内含子数量越多,基因形成剪接体的潜在能力越高,推测第Ⅰ亚组H v D U F 668基因形成剪接体的能力强于其它两个亚组㊂
蛋白保守基序分析结果(图4)显示,9个
H v D U F 668蛋白中共鉴定出10个保守的M o t i f ㊂所有成员均包含M o t i f 1与M o t i f 5,其中M o t i f 1包含D U F 668家族的典型特征保守结构域(29个氨基酸),M o t i f 5则包含D U F 3475家族保守结构域;推测这两个M o t i f 对大麦H v D U F 668的功能至
关重要㊂第Ⅰ亚组的H v D U F 668蛋白(H v D U F 668-01㊁H v D U F 668-02㊁H v D U F 668-09)都包含10个M o t i f
,且具有相同的排列顺序㊂第Ⅲ亚组H v D U F 668蛋白共包含6个M o t i f ,其中5个M o t i f (M o t i f 1㊁M o t i f 6㊁M o t i f 3㊁M o t i f 5和M o t i f 7)是该亚组所有蛋白共有的,且排列顺序基本一致;M o t i f 2仅在H v D U F 668-07和H v D U F 668-05检
测到㊂第Ⅱ亚组的H v D U F 668-03蛋白具有8个M o t i f ,而H v D U F 668-06蛋白则具有最少的M o t i f (4个)㊂总的来看,3个亚组均含有M o t i f 4㊁M o t i f
2㊁M o t i f 6和M o t i f 1;不同亚组间的M o t i f 组成存在差异,推测同一亚组大麦H v D U F 668蛋白具有相似功能,不同亚组的H v D U F 668则存在功能差异㊂
2.3 进化分析及共线性分析
将拟南芥(A r a b i d o p
s i st h a l i a n a )㊁亚洲棉(G o s s y p i u ma r b o r e u m )㊁玉米(Z e a m a y
s )㊁水稻(O r y z a s a t i v a )㊁野生稻(O r y z ar u f i p o g p o n )㊁二穗短柄草(B r a c h y p o d i u m d i s t a c h y
o n )和大麦(H o r d e u mv u l g
a r e )的D U F 668蛋白序列(共83条)进行比对,并构建系统进化树(图5)㊂结果发现,83条蛋白被分为3个亚族(Ⅰ亚族㊁Ⅱ亚族㊁Ⅲ亚族)
㊂其中,第Ⅱ亚族仅存在于单子叶植物,推测这一亚族是单子叶植物单独分化而来,或者在进化过程中双子叶植物丢失了这一亚族;第Ⅰ亚族与第Ⅲ亚族均含有单㊁双子叶植物,推测其起源于共同祖先,且D U F 668是高度保守的基因家族㊂大麦9个D U F 668蛋白中有7个相邻分支均是二穗短柄草,说明相比其它物种,大麦与二穗短柄草的亲缘关系更近㊂
共线性分析结果(图6)显示,大麦与水稻
D U F 668基因有6对共线性基因对,
大麦与玉米D U F 668基因有3对共线性基因对,大麦与拟南芥没有共线性基因对㊂这说明大麦与同属于单子叶禾本科的水稻的亲缘关系比属于双子叶植物的拟南芥更近;大麦与水稻的亲缘关系近于玉米㊂共线性基因对往往具有相同或高度相似的功能,推测大麦与水稻之间的6对共线性D U F 668基因具有相似功能㊂
图3 大麦D U F 668基因结构分析
F i g .3
G e n e s t r u c t u r e a n a l y s i s o f b a r l e y D
U F 668㊃261㊃麦 类 作 物 学 报 第44卷
图4 大麦D U F 668蛋白保守结构域与蛋白基序分析
F i g .4 A n a l y s i s o f t h e c o n s e r v e dd o m a i n s a n dm o t i f s o fD U F 668i nb a r l e
y
图5 D U F 668家族基因的多物种进化树
F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e o fD U F 668g e n e f a m i l y i nm u l t i -s p
e c i e s 图6 大麦与水稻和玉米D U F 668家族基因的共线性分析
F i g .6 C o l l i n e a r i t y a n a l y s i sD U F 668g e n e f a m i l y i nb a r l e y ,r i c e a n d s o y
b e a n ㊃
361㊃第2期
王月雪等:大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析
2.4 大麦D U F 668基因顺式作用元件分析
利用P l a n t C A R E 软件从大麦H v D U F 688基
因上游的启动区(起始密码子上2000b p
)进行顺式作用元件预测分析,结果发现,9个大麦H v D U F 668基因的上游启动区中共存在266个
顺式作用元件㊂根据功能将其分为4种类型:植
物生长,胁迫响应,植物激素响应和光响应(表3
和图7)㊂其中,参与植物激素响应的顺式作用元件数量最多,主要包括茉莉酸甲酯㊁脱落酸㊁生长素㊁赤霉素和水杨酸等响应元件;其次是光响应顺式作用元件,包括A A A 基序(光响应元件)和
A E -b o x
(光响应模块的一部分)等;植物生长类中鉴定出C A T -b o x (分生组织表达)和O 2位点(参与玉米醇溶蛋白代谢调节)等多个作用元件;胁迫响应原件有M B A ㊁C C A A T -b o x 等㊂4个类型中,激素响应元件和光响应元件的数量较大,分别为99和86个,推测H v D U F 668在大麦对激素响应中发挥重要的作用,并且其基因的转录可能受光周期的调控;逆境胁迫的响应元件含有57个,暗示该家族基因在大麦面对逆境胁迫时发挥了重要的作用;植物生长的响应元件数量最少(37个),证明该家族基因在大麦的生长过程中也有一定的作用㊂
表3 H v D U F 668基因的顺式作用元件
T a b l e 3 C l a s s i f i c a t i o no f c i s -a c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t s i nb a r l e y H
v D U F 668g e n e s 类型T y p
e 顺式作用元件C i s -e l e m e n t
光响应元件L i g h t r e s p o n s e e l e m e n t A C E ㊁S p
1㊁A T C T -m o t i f ㊁G -b o x ㊁B o x4㊁G T 1-m o t i f ㊁T C T -m o t i f ㊁A E -b o x ㊁A A A C -m o t i f ㊁A T 1-m o t i f ㊁G A -m o t i f ㊁T C C C -m o t i f ㊁B o x Ⅱ㊁c h s -C MA 2a 和G A T A -m o t i f
激素响应元件H o r m o n e r e s p
o n s e e l e m e n t A B R E ㊁A T -A B R E ㊁G A R E -m o t i f ㊁P -b o x ㊁C G T C A -m o t i f ㊁T G A C G -m o t i f ㊁T G A -e l e m e n t
㊁A u x R R -c o r e 和T C A -e l e m e n t 植物生长响应元件P l a n tG r o w t he l e m e n t
O 2-s i t e ㊁C A T -b o x ㊁R Y -e l e m e n t ㊁G C N 4-m o t i f ㊁M S A -l i k e ㊁c i r c a d i a n ㊁A -b o x 和H D -Z i p 1胁迫响应元件
S t r e s s r e s p
o n s e e l e m e n t M B A ㊁C C A A T -b o x ㊁W b o x ㊁WU N -m o t i f ㊁G C -m o t i f ㊁A R E ㊁L T R 和T C -r i c h r e p
e a t
s 图7 大麦D U F 668家族基因的顺式作用元件分析
F i g .7 A n a l y s i s o f c i s -a c t i n g e l e m e n t s o f b a r l e y D U F 668g e n e f a m i l y
2.5 大麦D U F 668家族基因在不同组织中的表
达分析
研究基因的时空表达模式有助于了解基因潜
在的功能[24
]㊂对大麦D U F 668基因在8个不同
组织中的表达量进行分析,结果(图8)显示,H v D U F 668-01与H v D U F 668-02基因在这8个组织
中均有非常高的表达量,暗示这2个基因对大麦生
长发育有重要的作用;H v D U F 668-07基因在这8
个组织中表达量极低,甚至不表达;H v D U F 668-09㊁
H v D U F 668-04与H v D U F 668-06基因在某些特定
组织中表达量处于中等水平;H v D U F 668-03㊁H v D U F 668-05和H v D U F 668-08基因在这8个组织
中表达量都相对较低㊂H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-
06和H v D U F 668-09基因在幼苗㊁
根和节间的表达量明显高于其在花序与颖果等组织中的表达量;H v D U F 668-03基因则在颖果中的表达量明显
高于其他组织,而且随着颖果的发育而增加;
H v D U F 668-02和H v D U F 668-09基因在颖果中的
表达量则是随着颖果的发育而降低㊂总的来看,H v D U F 668基因的表达具有明显的组织特异性,而且在不同的发育阶段其表达量也不同㊂除
H v D U F 668-07基因外,
其余8个基因在大麦被分析组织中都有表达,这进一步证实了H v D U F 668基因在大麦的生长发育等方面发挥着特定作用㊂
㊃461㊃麦 类 作 物 学 报 第44卷
图8 大麦H v D U F 668基因在不同组织中的表达量
F i g .8 E x p r e s s i o no f b a r l e y H
v D U F 668g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s 2.6 大麦D U F 668家族基因在不同胁迫下的表
达分析
为了探索H v D U F 668基因在不同胁迫下的
表达模式,用1种激素(M e J A )㊁2种环境胁迫(干旱㊁暗处理)以及1种生物胁迫(大麦黄矮病毒侵染)对大麦幼苗进行了处理,利用q R T -P C R 分析处理后不同时间H v D U F 668基因的相对表达量,
引物序列如表4㊂结果(图9)显示,与C K 相比,胁迫处理12h 的大麦叶片中,有6个H v D U F 668
基因表达发生显著变化;有3个H v D U F 668基因在病毒侵染后与未侵染相比表达显著增强㊂对照C K 中,随着时间推移,H v D U F 668-01㊁
H v D U F 668-02和H v D U F 668-05的相对表达量先
升高后降低,H v D U F 668-08的相对表达量先降低
后升高,H v D U F 668-04的相对表达量降低,
H v D U F 668-09的相对表达量升高㊂
经M e J A 处理后,随着时间推移,H v D U F 668-01和H v D U F 668-09表达量先上升后降低,在24h 时表达量最高;H v D U F 668-02和H v D U F 668-05表
达量先下降后上升;H v D U F 668-04和H v D U F 668-
08表达量逐步上升,H v D U F 668-08表达量变化显著,48h 时较C K 增加40倍㊂推测该基因在激素
表4 q R T -P C R 分析所用引物
T a b l e 4 P r i m e r s u s e d i nR T -q P C Ra n a l y
s i s 基因名称
G e n en a m e
上游引物(5'-3'
)F o r w a r d p
r i m e r 下游引物(5'-3'
)R e v e r s e p r i m e r
H v A c t i n C C A C G A G A C G A C C T A C A A C C A C T G A G C A C G A T G T T T C C H v D U F 668-01A G G C A T G A C A G A C A C A G C A G C A G A C C A T C A A G C C T G T C A A H v D U F 668-02A A G G C T C A T C A T G G T T T T G G G A T G C T G A A G C G A T A C G A C A H v D U F 668-04T A C G C G A A C G T G A T C T T G T C T C C T C T C A A C C T C T C C C T C A H v D U F 668-05G T G G A T G C T C G A A A G A G G T C A C T G G A A T C C T C G T T G T T G G H v D U F 668-08A G C A G G A C G T G A A G A A C C T C C C T C C A T C G A C A T G G A C T T T H v D U F 668-09
T T G T A C C A T G G A C T G C C A G A
C C A T G T C A C T C C C G A A G T T T
㊃
561㊃第2期
王月雪等:大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析
误差线表示标准误差;图柱上方*和**表示处理与C K间的相对表达量差异在0.05和0.01水平显著㊂
T h e e r r o r b a r r e p r e s e n t s t h e s t a n d a r d e r r o r;*a n d**a b o v e c o l u m n sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t sw i t hC Ka t 0.05a n d0.01l e v e l s,r e s p e c t i v e l y.
图9不同胁迫下9个基因相对表达量分析
F i g.9E x p r e s s i o n p r o f i l e a n a l y s i s o f t h e n i n e H v D U F668g e n e s i nb a r l e y u n d e r d i f f e r e n t s t r e s s e s
响应中起着至关重要的作用㊂
经P E G6000处理后,随着时间推移, H v D U F668-02表达量先降低后升高,H v D U F668-04呈上升趋势,但在48h表达量大幅度升高;
H v D U F668-01和H v D U F668-08表达量逐渐上升,H v D U F668-08在48h时表达量最高;
㊃661㊃麦类作物学报第44卷
H v D U F668-09表达量先升高后降低,在24h表达量最高,较C K高10倍㊂推测这2个基因与干旱胁迫有关㊂
经暗处理后,随着时间推移,H v D U F668-02和H v D U F668-05表达量呈降低趋势,H v D U F668-04的表达量在48h开始上升;H v D U F668-01与H v D U F668-08表达量升高,H v D U F668-01在24 h表达量最高,H v D U F668-08在12h时表达量较C K高30倍左右,推断该基因对光响应敏感程度较高,在光反应中可能起着关键的作用㊂
前人研究发现,含有A v r9/C f-9的水稻具有抗病性[10]㊂系统进化分析中,发现H v D U F668-04㊁H v D U F668-05和H v D U F668-08与水稻含有A v r9/C f-9的基因同属于第Ⅲ亚族㊂因此对这3个H v D U F668基因进行黄矮病毒侵染,结果发现,H v D U F668-04㊁H v D U F668-05和H v D U F668-08表达量发生了显著变化,表达量较C K高100~180倍㊂说明这3个基因在大麦遭受黄矮病侵染时发挥重要作用,可能介导大麦的生物防御反应㊂
3讨论
D U F家族最初是一类功能未知的超基因家族,随着研究的深入,部分功能被发掘㊂本研究在全基因组和蛋白数据库的基础上,利用两种预测工具(HMM
E R㊁S MA R T)共同预测并鉴定出了9个大麦H v D U F668基因,这比单一软件预测结果会更可靠,但可能漏掉非典型大麦D U F668蛋白,是本研究的缺点㊂
本研究基因结构分析发现,第Ⅲ亚组中的H v D U F668-04和H v D U F668-05基因没有内含子,第Ⅰ亚组最多,为11个,第Ⅱ亚组分别有7个和9个,这与水稻与棉花中基因结构相似[10-11]㊂对蛋白基序分析后发现,除大麦H v D U F668-06蛋白外,其他8个蛋白均含有2个高度保守的D U F668和D U F3475结构域,这与前人研究相似[10-11]㊂另外,本研究还在P f a m数据库中发现,该家族90%以上的成员中,这2个特征结构域是共存的(2148条蛋白序列中有1961条序列包含这2个特征结构域)㊂本研究还发现,D U F3475特征结构域均位于D U F668保守结构域的前面,在进化过程中这2个结构域的排列顺序高度保守,推测两者之间在功能上可能存在着一定的联系㊂
本研究中,系统进化分析将大麦D U F668蛋白分为3个亚族㊂其他物种研究中,将其分为2个亚族[10-11]㊂不同亚族间的基因结构及基序排列都有一定差异㊂依据多物种系统进化树可知,第Ⅰ亚族与第Ⅲ亚族均含有单双子叶植物,推测D U F668家族基因起源于共同祖先,是一个高度保守的基因家族㊂研究发现,四倍体棉花品种比二倍体的棉花品种的D U F668家族成员多两倍,推测D U F668家族成员在物种中数量与几倍体相关㊂本研究材料大麦为二倍体植物,共鉴定出9个D U F668基因,与前人研究8种禾本科代表作物(103个)得出单子叶禾本科植物中D U F668家族成员数量相近[11]的结论一致㊂
本研究在共线性分析中发现,大麦与拟南芥及棉花基因组间虽然存在着共线区块,但未发现共线性基因对(结果未给出);但在大麦与水稻间存在的共线性基因对中,发现1个大麦的H v D U F668基因对应2个O s D U F668基因,同时也有1个水稻O s D U F668基因对应2个大麦H v D U F668基因;在大麦和玉米间存在的共线性基因对中,存在1个大麦的H v D U F668对应3个玉米Z m D U F668基因的现象,这可能是由串联和片段复制驱动的基因扩增事件所导致的㊂在水稻中,许多具有高度相似序列的基因在染色体上以同源基因对的形式聚集[11],但在本研究大麦种内共线性分析中,鉴定出的9个基因之间并没有共线性关系㊂
本研究对表达模式分析后发现,H v D U F668-01㊁H v D U F668-02和H v D U F668-09在8个组织中都表达,并且这3个基因均是高量表达,且同属于一个亚组㊂这在棉花中也出现了类似情况[11]㊂大麦H v D U F668-04㊁H v D U F668-05和H v D U F668-08在黄矮病病毒侵染下呈现高量表达,这3个大麦成员与水稻包含A v r9/C f-9的成员[10]同属一个亚族,推测这3个基因有助于提高大麦对病原菌的防御能力,也可能含有A v r9/C r-9,介导大麦的生物防御反应㊂有关此家族在大麦生长发育和抗胁迫反应中的具体功能及机制尚需更多研究㊂
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第2期王月雪等:大麦D U F668家族基因鉴定及表达分析
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