组培——精选推荐

植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境的条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。

根据培养的可分为：愈伤组织培养、悬浮培养、器官培养、茎尖分生组织培养、原生质体培养。

根据培养过程分为：初代培养、继代培养、生根培养
根据培养基的物理状态分为：固体培养，液体培养，半固体培养，双层培养
脱分化：也称去分化，是指离体培养条件生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特征的细胞的过程。

再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官、甚至完整植株的，这个过程成为再分化。

*器官发生型：由愈伤组织不同部位产生不定芽或不定根，而且通常是单极性的。

*胚胎发生型：由愈伤组织产生胚状体或称体细胞胚，胚状体是双极性的，芽根间有维管组织连接，可独立生长完成整植物体。

*外植体：在植物组织培养中，由植物体上取下来，进行离体培养的那部分组织或器官。

植物组培的应用：
1理论研究反面的应用：研究细胞分化和器官建成影响因素的主要方法。

2快速繁殖：离体诱导不定芽分化和促进腋芽增殖。

3人工种子制备：通过诱导体细胞胚（胚胎发生）制备人工种子。

4次生产物生产：有用化合物工业化生产。

5脱毒培养：离体茎尖培养技术可脱去病毒，解决无性繁殖植物品种退化。

6植物种植资源的保存和交换，保存物种多样性。

7遗传操作a突变体的筛选b离体授粉及胚胎培养：克服远远杂交不亲和性（受精前/后障碍）c原生质融合：可获得有性杂交不能产生的杂种，产生细胞质杂种d单倍体诱导：花药培养技术可缩短杂合体纯合时间，加速育种进程e遗传进化：基因工程不可缺少的部分。

一准备室：材料，培养器械的清洗，培养基准备，灭菌的工作。

*1普通化学实验室：仪器及设备化学药品（纯水仪，冰箱，过滤灭菌器，电炉，微波炉，磁力搅拌器，低速台式离心机，电脑等。

作用：配置培养基
*2洗涤室：清洗，贮存仪器设施，鼓风干燥等。

作用：玻璃器皿用具的清洗及存放。

3灭菌室：仪器室设备，用具的灭菌。

高压蒸汽灭菌：培养基，器械，棉塞等消毒灭菌；细菌过滤灭菌：用于液体培养基灭菌装置，不耐高温高压的活性物质的灭菌。

二无菌操作室：进行植物材料分裂接种的重要场所，需要长时间的无菌操作，对组织培养起关键作用。

设施：超净工作台，紫外灯，消毒器，广口瓶，酒精灯，机械支架，手术剪，解剖针。

三培养室：进行植物材料的培养的场所。

（适用于器官（芽、茎、花药等），愈伤组织，细胞和原生质体的培养）
设备：可控光，温，湿度设备，；固定式培养架转床，摇床。

*四细胞学实验室：细胞学和组织学的观察
设备：高倍显微镜，体视显微镜，倒置镜
五温室：组培苗的移栽锻炼。

灭菌的方法：干热灭菌：玻璃器皿；高压蒸汽灭菌121℃15-20min玻璃器皿，器具，培养架；熏蒸灭菌：培养室，接种室；过滤灭菌：活性物质的灭局；药剂灭菌：培养器材的灭菌；灼烧灭菌：接种器具的灭菌；射线灭菌：培养室，接种室。

培养基的成分
水分
无机盐
碳源：维持培养基合适的渗透压，对原生质体和初生壁的完整性十分重要，提供能量，合成有机物的碳源。

氮源：提供N元素。

维生素：直接参与生物催化剂(E)的形成，蛋白质，脂肪代谢等重要的生理功能。

主要是b族维生素。

*附加物：a琼脂：组织培养支持物b琼脂糖：改善培养物供养状况c聚乙烯，吡咯烷酮，Vc，硝酸银：可防止材料褐变e活性炭：具有吸附的能力，减少有害物质的影响，减少酚类物质污染而引起植物死亡，
有利于营养物质的释放，有利于某些植物的生根。

生长调节剂：促进培养的材料生长。

基本培养基的种类：
MS培养基：主要的特点是无机盐含量适宜，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富。

*元素平衡较好，缓冲性能好。

Nitsch/Miller培养基：：中等无机盐
B5培养基：培养基盐类浓度较高，铵态氮含量较低，但硝酸钾和盐酸硫胺素含量较高。

*White/ws/he培养基：无机盐含量非常低（1/4ms）有机成分也很低。

诱导培养基：诱导脱分化，生长素含量较多。

继代培养基：诱导出愈伤组织后……
分化培养基：由愈伤组织诱导成小苗。

生根培养基：
单细胞培养：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。

单细胞的分离：
一机械法：a刀片刮法b研磨离心法
特点：1细胞不受酶的伤害2不会发生质壁分离3适用于薄壁细胞组织排列松散、细胞间接触面很小4产量低
二酶解法
特点：酶解法分离细胞能得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞，产量高，可用于大多数细胞。

三从愈伤组织获得
*震荡的作用：1可对周围细胞形成一定的压力，使之破碎成小细胞团或单细胞2震荡可以使细胞或细胞团在培养基中分布均匀3进行培养基和容器内的气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。

单细胞培养方法：
1平板培养：a选择合适的培养基，以降低细胞培养的梅毒b选用分裂旺盛的细胞（此时分裂能力强，不用久处于静止期的细胞)c培养基的温度适宜（35°C）
2看护培养：*把单细胞放到一块活跃生长的愈伤组织上培养，活跃生长的愈伤组织所分泌的代谢产物为单细胞分裂提供一些活性物质。

3微室培养法：将单细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的一种方法
优点：在培养过程中可以连续的观察，把一个细胞的生长，分裂和形成细胞团的全部过程记录。

4条件培养：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化，*使原来在合成培养基上不能分裂的细胞发生分裂。

细胞生长周期：
1延趾期：细胞很少分裂，细胞数目不增加
2对数增长期：细胞分裂活跃，数目迅速增加
3直线生长期：细胞增殖最快的时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定，细胞数目达到最高峰。

4缓慢期：营养物质耗尽，或是有毒代谢物的积累，细胞的增长逐渐变慢
5静止期：细胞的数目不再增加。

悬浮培养中细胞生长的测定：a细胞计数b细胞总体积及细胞密实体积d细胞的干重和鲜重e细胞有丝分裂的指数f细胞植板率g蛋白质和核酸的含量
培养细胞活力的测定
1TTC法：四唑盐还原法，活细胞呼吸作用可以产生还原力，可以将三苯四唑氯化物（TTC）还原成红色染料。

细胞计数或提取后用分光光度计（520nm）测定
2FAD法：荧光素二乙酸法，活细胞内FAD分解产生荧光素，并积累，所以在荧光显微镜下观察到的产生荧光的细胞是有活力的细胞。

3伊凡蓝染色法，FAD的互补法，只有死细胞和活力受到损伤的细胞能吸收伊凡蓝，而完整的细胞不能摄取或积累这种染料。

*测定电导率→营养物质减少；光密度→细胞数目增多
人工种子：任何一种经人工种皮包被或裸露的具有形成完整植株能力的繁殖体均可称为人工种子。

人工种子的结构：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮。

影响原生质体数量和活力的因素：1光：一般黑暗条件下进行2温度：25-30℃3时间：几小时到几十小时，时间太长，影响原生质体活力4细胞壁降解酶的种类和组合：纤维素酶0.7~1％果胶酶0.5~1％5渗透压稳定剂的种类：甘露醇，蔗糖，葡萄糖6原生质膜稳定剂7PH影响
渗透压稳定剂：
分为两大类：1由糖醇或可溶性糖（如甘露糖，山梨醇，葡萄糖和蔗糖），目前多采用这种。

2是无机盐溶液，，由氯化钙、硫酸镁、氯化钾或培养基中的无机盐组成。

质膜稳定剂：为提高质膜稳定性和增加原生质体的数量，可在酶液中添加多聚阳离子和无机离子（氯化钙）作为质膜稳定剂。

一般添加0.5％~1.0％的葡聚糖硫酸钾或0.1％二水氯化钙。

钙能为膜蛋白所束缚，提高膜的钙含量可增加质膜稳定性。

葡聚糖硫酸钾能抑制酶液内某些酶如RNA聚合酶的活性，有助于质膜的稳定。

融合的原理：1化学法融合的原理：带有阴离子的PEG分子等与原生质体表面的阴离子之间在钙离子的链接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和结合。

在钙离子—高PH液的处理下，钙离子和与质膜结合的PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使原生质体的某些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷链接起来，吸附聚集，最后融合到一起。

2物理法融合的原理：对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生质体偶极化并沿着电场的方向片列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使粘合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜链接，闭合，最终溶为一体。

1PEG融合法：优点：成本低，不需要特殊的设备，融合子产生异核率高，其过程不受物种的限制。

缺点：过程繁琐，PEG对细胞可能有毒害。

2电融合法：优点：不对细胞有毒害，融合率高，融合技术操作简便。

缺点是设施昂贵。

一杂种细胞的选择
1互补筛选法：利用双亲细胞在生理或遗传特性方面所产生的互补作用来进行选择。

在选择性培养基上只有互补作用的杂种细胞才能生长，非杂种细胞没有互补不能生长发育。

A激素自养互补选择：双亲任何一方原生质体在培养基上生长时需要添加植物生长调节剂，而异核质体杂种细胞由于融合后的互补效应，自身能产生内源激素，不需要添加植物生长调节剂也能在培养基上生长发育。

B白化互补选择c营养缺陷性互补选择d抗性突变体互补选择e基因互补选择2机械筛选法a天然颜色标记分离：利用不同颜色的原生质体进行融合，挑选出异核体b荧光素笔记分离（FITC绿色RITC红色）：首先在两亲本的原生质体群体中分别导入无毒性的不同荧光染料，融合后根据两种荧光染料的存在可把异核体区分开。

C荧光活性自动细胞分类器分类融合。

二杂种植株的选择
1形体学鉴定：根据杂种植株的表型特征进行鉴定，如株型，叶形，花色等
2细胞学鉴定：杂种细胞的细胞核、染色体以及细胞器的特征是鉴定杂种的重要依据
3生物化学鉴定：利用亲本的某些生化特征作为鉴定指标
4分子生物学鉴定：利用特异性限制性内切酶对融合体再生植株的叶绿体和线粒体基因组进行没切和电泳分析，可确定再生植株细胞质中不同亲本细胞器DNA的组成情况，来鉴定是否为杂种植株。

体细胞无性系变异：在离体培养条件下，没有发生雌雄配子的受精，因此把任何形式的细胞培养所产生的植株统称体细胞无性系，而把这些植株所表现出来的变异称为体细胞无性系变异。

（染色体数目变异，染色体结构变异）
体细胞无性系包含对了双重性：遗传的稳定性和变异。

植物细胞工程目前分为五个分支：1脱毒与快繁2细胞大量培养3体细胞杂交4细胞遗传转化及生产转基因植物5无性系变异与分离突变体。

*离体筛选的优点：1由于筛选可以在离体的条件下进行，从而可以在小空间内对大量的个体进行选择。

2细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节的限制，因此筛选的效率高3因为实验室在人工设计下的，所以具有目的性。

离体筛选的意义：1对作物进行遗传改良2为体细胞和转基因技术提供选择标记如互补选择3为突变体细胞进行遗传和生理代谢的研究。

离体条件下遗传变异的特点：
普遍性：可发生在各种培养类型中，各种植物培养中，各种营养类型
局限性：从表型上看，在不同植物类型经常发生的体细胞变异主要是植株形态，生长势，育性，某些抗性
嵌合性：同一有机体中，同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。

影响植物体细胞无性系变异的主要因素：
1供体植物：a供体植物倍性水平（*单倍体易发生变异，多倍体和染色体数目较多的植物其变异的频率比二倍体和单倍体高）b基因型c外植体分化的程度：分化程度高，变异高；分化程度低，变异少）2培养基及培养方式：不同的激素的浓度；培养基的物理状态及培养类型。

3继代培养的次数：一般来说，继代培养的时间越长，继代越多，变异越多。

花药与花粉培养：指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体的发育途径，转向孢子体途径形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并坚定出单倍体植株后，使之二倍体的技术。

单倍体：指具有配子体染色体组的孢子体。

或具有配子染色体数的细胞或个体
单倍体发生方式：1孤雌生殖2孤雄生殖3无融合生殖：胚囊中由卵细胞以外的其他细胞（反足细胞，助细胞）发育成的单倍体植株。

4人工诱导单倍体途径：a花药和花粉的培养b胚胎培养（离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞发育成植株）
雄核发育途径：
1A途径：小孢子的第一次有丝分裂安配子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞
*a-v途径：多细胞花粉（或多和花粉）由营养细胞重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一次至数次后存在于多核花粉的一侧，有的甚至直到球形胚形成的时候仍他存在。

*a-g途径：生殖细胞进行多次分裂形成配子体，营养细胞不分裂或仅分裂数次形成胚柄结构。

*a-vg途径（又称E途径）花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各细胞群的子细胞都类似其母细胞。

*c-途径：在获得的花粉植株群体中，除单倍体外，常有相当比例的二倍体，三倍体，四倍体，非整倍体等非单倍体植株，即小孢子培养过程中自发加倍现象。

2B途径：小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞（或游离核）。

以后由这两个细胞（或游离核）连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。

单倍体植株应用：
1单倍体育种：缩短育种进程，加速下代杂合体纯化。

2对二倍体植物加倍变成四倍体或倍性更高的多倍体，可以改善原来的植物的某些经济性状
3对异花授粉作物的单倍体植株进行加倍，可迅速获得自交系，免去了繁琐的人工去自交过程
4有利于进行突变体的选择。

影响花药培养的因素：
1植物基因型
2植株生长条件和生理状态
3花粉发育时期
4预处理：a高低温处理b化学物质处理（*高糖*甘露醇*秋水仙素*乙烯利）c其他（γ射线*离心*磁场）5培养基（*基本培养基*碳源*氨基酸和其他有机物质*植物激素*活性炭*PH）
6培养条件（温度*光照*植板密度）
7花药壁因素
植物胚胎培养：植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠、和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。

包括：试管受精、胚培养，胚珠培养，胚乳培养，子房培养。

幼胚指的是：尚未成熟即发育早期的胚。

幼胚培养时的发育方式：
*继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，形成成熟胚再按种子萌发方式形成完整植株。

*迅速萌发为幼苗，不能维持胚性生长，这种情况称为“早熟萌发”
*形成愈伤组织：多数情况下，幼胚在离体培养中，首先细胞分裂形成愈伤组织，再分化植株。

胚培养的应用：*克服远缘杂交不亲和性*打破种子休眠*缩短育种周期*克服种子自然不育性
胚培养的方法（胚发育过程可以分为两个过程：*异养期*自养期）
1Monnier：在一个培养皿中装入两种不同的培养基，即在培养皿中央放一个玻璃容器，将第一种较简单的琼脂培养基加热融化，注入到玻璃容器外围，形成外环。

待第一种培养基冷却凝固后，将玻璃容器拿掉，形成一个中央圆盘，然后在圆盘中注入成分较复杂的第二种培养基，将幼胚放置于第二种培养基上培养。

2利用胚乳看护培养，可以显著提高幼胚的成活率：把杂种离体幼胚嵌入到双亲之一的胚乳中，然后对其
进行培养。

离体授粉：指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，又称离体受精。

离体授粉的意义：可以克服远缘杂交过程中的受精前障碍，获得可育的种子。

离体授粉的类型：
*离体柱头授粉：通过雌蕊离体培养，使无菌花粉落于柱头上，得到含有可育的种子和果实的技术
*离体子房授粉：通过人工方法将花粉直接引入到子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行正常的受精，最后获得具有生命力的种子，又称子房内授粉。

*活体子房授粉（*直接引入法*注射法）*离体子房内授粉。

*离体胚珠授粉：离体培养未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最终在试管内长出正常种子的技术。

——可以克服柱头和花柱组织上出现的两性不亲和性。

植物离体快繁：利用植物组织培养技术，对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的的方法
优点：*繁殖效率高*培养条件可控*占用空间小*管理方便，利于自动化控制*便于种质保存和交换。

缺点：*生产成本高*缺乏生产经验*受市场制约*试管苗生产性能不稳定。

植物快繁应用：
*短期内获得大量性状一优良，整齐一致的种苗群体
*大量繁殖原来常规方法不能进行无性繁殖，难繁殖，繁殖速度慢的植物，尤其对一些珍稀濒危的植物繁殖更有意义。

*作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。

*通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的。

*种质资源的保存和交换。

快繁的途径：*短枝发生型*器官型*器官发生型*胚胎发生型*圆球茎发生型
快繁的基本程序：
*无菌母株的制备：性状优良，稳定，生长健壮，无病虫害植株上的外植体
*继代芽的增殖：
驯化现象：在快繁过程中，随培养时间和继代的次数增加，芽分化和生长的速率降低，称为驯化现象。

调节激素配比或温度处理，提高繁殖速度。

*芽苗的生根培养：（*试管内生根：将无菌小枝条转入生根培养基进行培养。

生根培养基的营养元素含量往往降低需要适量提高生长素物质的浓度降低细胞分裂素的浓度降低无机盐和有机物含量降低渗透压另外暗培养生根。

*试管外生根：有些植物可以将离体条件下形成的枝条在基部切口处用生根粉或滑石粉混合的IBA涂抹然后种植到温室或大田里这样的方法可以大大降低成本。

*再生植株的锻炼和移栽：
移栽后植株死亡的原因：*根系结构不完善*叶部结构不完善
炼苗措施：日光炼苗，温度炼苗，湿度炼苗
克服：*闭瓶炼苗7-10d*开瓶炼苗3-7d培养壮苗
注意：*将小苗根系周围培养基清洗干净，以避免有害微生物污染*筛选适宜的移栽基质：保水性、通气性（砂、蛭石，腐叶和土壤的配比）*选择使用营养钵，苗床，或塑料薄膜以及遮阳网，调控光，温度，湿度。

植物茎尖分生组织无病毒的原因：1，病毒一般通过维管束系统在植株体内移动，而分生组织中没有该系统。

2，分生组织细胞分裂旺盛代谢活性高病毒无法在其中复制。

3，茎尖存在高水平的内源生长素可抑制病毒的复制。

4.，茎尖分生组织有高活性的病毒纯化系统。

热处理脱毒的机理：热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内的增殖减缓或停止，失去侵染能力。

热处理也可以加速植物细胞的分裂，使植物在与病毒繁殖的竞争中取胜。

脱毒植株的检测：
*直接测定法：依据形态和病症
*指示植物法：指示植物：接种某种病毒后能迅速表现特有症状的植物
*抗血清鉴定法：病毒是良好的抗原，给动物注射后，动物就会产生抗体，存在血清中，含抗体的血清差称抗血清，其原理主要依据抗原和抗体的特异反应。

*电子显微镜法：通过电子显微镜可以直接检测出有无病毒的存在。

*核算分析法：通过核算杂交和PCR法检测目标的和算序列。

种植资源：又称品种资源遗传资源或基因资源，是生物多样性的重要组成部分，是选育优质高产抗病抗逆新品种的。

常温保存法：
*提高渗透压：减少离体培养从培养基中吸收养分和水分减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度。

*添加生长抑制剂：（ABA、青鲜素）
*降低氧分压：抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老。

*干燥保存法：降低水分，延缓生命活动。

0*饥饿法：从培养中减去某种或几种营养元素，或者降低某些营养物质的浓度。

低温保存法：指离体培养的方式，在非冻结程度的低温下保存种质的方法
超低温保存法：将植物离体材料经过一定方法处理后在超低温（-196℃）的条件下进行保存。

常用的冷冻剂：二甲亚砜，脯氨酸，甘油，糖类。

超低温保存种植资源是指将植物的离体材料包括茎尖（芽），分生组织，胚胎，花粉，愈伤组织，悬浮细胞，原生质等经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件进行保存的方法。

基本程序：植物材料（培养物）的选取，材料的预处理，冷冻处理，冷冻贮存，解冻，细胞活力和变异评价，在培养。

预处理的目的：使材料适应将遇到的低温条件，提高分裂细胞的比例。

因为分裂细胞小，细胞内含水少，在冷冻过程中细胞内不易有大冰晶形成，细胞不易受害。

冷冻处理：慢冻法，快冻法，预冻法和干冻法。