PCR技术

PCR反应系统的组成
• 三、PCR反应系统的组成 • 引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓度 引物经济、特异，但浓度过低，不足以完 成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产 率。
PCR反应系统的组成
• 四、TaqDNA聚合酶的量 • 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl， 常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同 和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的 用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的 增加。由于生产厂家所用兵配方、制造条件以 及活性定义不同，不同厂商供应的TaqDNA聚 合酶性能也有所不同。Cetus公司酶定义是：1 个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃， 30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分 所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺 入量。
电泳分析
• 在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情 况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭 （EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备 好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制） 放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分 子量标准品作标记 • 由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在 紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强 80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可 直接观察
原理
• 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、 退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两 条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循 环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板， 每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以 2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循 环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实 际上一般可达106～107倍。
PCR的种类
• • • • • • • 复合PCR 反向PCR 标定PCR 固定PCR 荧光PCR 加端PCR 不对称PCR
原理
• PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法， 主要由高温变性、 低温退火和适温延伸三 个步骤反复的热循环构成：即在高温 （95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性 成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～ 55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸 引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分 双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以 引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料， 沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链
Information about PCR
• PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩 增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点。 • PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室 Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的 • 最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应 用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的 产前诊断。随后使用了1976年Chien等分离的 热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化， 并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等 完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用 阶段。
PCR反应系统的组成
• 二、四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs） • 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会 抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少 在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高 浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势 必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～ 200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四种 dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或 偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成 速度，过早终止反应
PCR反应Leabharlann 统的组成一、 PCR缓冲液（PCrBuffer） Mg2 浓度Mg2 的最佳浓度为1.5mmol/L（当 各种dNTP浓度为200mmol/L时），但并非对 任何一种模板与引物的结合都是最佳的。 首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～ 10mmol/L。Mg2 过量易生成非特异性扩增 产物，Mg2 不足易使产量降低
Information about PCR
• PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子 生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。 • 1993年度诺贝尔化学将已于10月13日揭晓，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。 现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量 遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症 铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR方法已经 广泛应用于生物医学中。该方法同DNA测序法结合 起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工 具。”一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同 享此荣。
影响PCR的主要因素
• 三、DNA聚合酶 • 在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发 现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ纯 品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条 多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为 两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合 酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段 （Klenow fragment）。另一个片段分子量为 34000，具有5’→’3’外切酶活力
影响PCR的主要因素
• 二、引物引物设计 • 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物， 所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互 补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的 长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位 置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位 置和结果的关键，引物设计也就更为重要。 • 引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序 列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这 两段已知序列一般为15～20个碱基，可以用DNA合 成仪合成与其对应互补的二条引物
影响PCR的主要因素
• 一、温度循环参数 • 在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性 与退火的温度。如操作范例所示，其变性、 退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段 500bp。在这里，每一步的时间应从反应混 合液达到所要求的温度后开始计算。
PCR操作范例
• PCR基本原理示意图（如右图）：在一个 典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲 液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多 聚酶、Mg2 和两个合成的DNA引物。模板 DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃ 退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前 模板预变性3～5min；在末次循环后，样品 仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的 DNA为双链DNA
What is PCR
聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术 (“free bacteria”cloning technique)，是一种对特 定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反 应。该方法一改传统分子克隆技术的模式， 不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使 几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增 10^7～10^8倍，大大提高了DNA的得率。已广 泛应用到分子生物学研究的各个领域。
影响PCR的主要因素
• 三、DNA聚合酶 • Taq 酶在95℃的半寿期为40min，故在PCR循 环中选用的变性温度，不宜高于95℃。 • 影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 离子 的影响
改进实验
• ①退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹 配的杂交，从而提高特异性。②减短退火时间及延 伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚 体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以 减少错误引发，尤其是引物的二聚化。④改变 MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高 反应严格性或者对Taq酶的直接作用。⑤模板中如果 存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹 结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮 -2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3： 1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代 替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。
原理
• ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺 嘌呤Ａ对胸腺嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ） 组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制时， 解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板， 然后，另一种酶－－ＲＮＡ聚合酶合成一小段 引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上， 最后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成 与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外 模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所 研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合 成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端， ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。
PCR反应系统的组成
• 五、模板 • 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。 若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一 条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚 至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的 特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单 拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为 起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何 蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及 能结合DNA的蛋白