ADAM17-shRNA转染的BMSCs对乳腺癌移植瘤ADAM17、EGFR和Ki-67的影响

ADAM17-shRNA转染的BMSCs对乳腺癌移植瘤
ADAM17、EGFR和Ki-67的影响
贾文婷;陈国福;张雪鹏;张笑博;孙影;赵莹
【摘要】目的探讨利用裸鼠乳腺癌荷瘤模型转染解聚素-金属蛋白酶17 (ADAM17)-shRNA的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对乳腺癌移植瘤的抑制效果.方法将人乳腺癌细胞(MCF-7)接种于30支裸鼠皮下,14 d后乳腺癌荷瘤裸鼠模型成功构建.随机分为:转染组(注射1×106/ml转染ADAM17-shRNA的BMSCs)、BMSCs组(注射1×106/ml BM-SCs)和对照组(注射空白PBS).采用贴壁筛选法分离、培养3周龄雄性SD大鼠的BMSCs,利用慢病毒介导将AD-AM17-shRNA转染第3代培养的BMSCs,将其通过尾静脉注射给各组荷瘤裸小鼠(0.1 ml/次)3d重复一次,共5次,观察各组裸小鼠肿瘤的生长状况.抑瘤实验16 d后处死裸鼠,HE染色法观察各组瘤体的形态结构,免疫组化法检测各组瘤体ADAM17、表皮细胞生长因子受体(EGFR)和细胞增殖核抗原(Ki-67)的表达.结果转染组、BMSCs组、对照组裸鼠瘤体体积分别为(375.09±20.72)、(768.85±35.55)、(783.75±27.30) mm3,转染组相较于对照组移植瘤体积缩小,差异有统计学意义(P＜ 0.05),而BMSCs组差异无统计学意义.HE染色镜下可见,与对照组相比转染组可见瘤体组织大片坏死区域、坏死区域细胞崩解、细胞结构消失,而BMSCs组与对照组差异无统计学意义.转染组ADAM17、EGFR、Ki-67蛋白与对照组相比表达均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);BMSCs组和对照组相比较,差异无统计学意义.结论ADAM17-shRNA通过BMSCs介导可靶向归巢至裸鼠乳腺癌移植瘤并发挥抑制裸鼠乳腺癌ADAM17、EG-FR和Ki-67表达的作用.
【期刊名称】《安徽医科大学学报》
【年(卷),期】2018(053)004
【总页数】7页(P589-595)
【关键词】乳腺癌;RNA干扰;解聚素-金属蛋白酶17;骨髓间充质干细胞
【作者】贾文婷;陈国福;张雪鹏;张笑博;孙影;赵莹
【作者单位】华北理工大学附属医院肿瘤外科,唐山063000;华北理工大学附属医院肿瘤外科,唐山063000;华北理工大学附属医院肿瘤外科,唐山063000;华北理工大学附属医院肿瘤外科,唐山063000;华北理工大学基础医学院病理学系,唐山063000;华北理工大学图书馆,唐山063000
【正文语种】中文
女性多发的恶性肿瘤之一乳腺癌，其治疗领域研究的热点基因靶向治疗日趋显露头角[1]。

其中沉默解聚素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease 17,ADAM17)靶点研究最为深入。

RNAi技术下调ADAM17表达，可以逆转乳腺癌细胞的恶性性状[2]。

该课题组前期实验证明ADAM17-shRNA可有效地抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭能力并抑制荷瘤鼠乳腺癌细胞和动物水平的生长[3-4]。

骨髓间充质干细胞(bone mesenehymal stem cells, BMSCs)是一种干细胞，可转染外源基因，定向归巢至机体肿瘤形成部位，使外源基因靶向表达，从而达到治疗效果[5]。

该实验利用裸小鼠乳腺癌荷瘤模型，慢病毒介导将ADAM17-shRNA转染BMSCs，并通过尾静脉注射入裸小鼠体内，观察裸小鼠的生长状态并记录移植瘤的体积。

HE染色观察各组裸鼠瘤体形态特征；免疫组化法检测各组瘤体
ADAM17、表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和细胞增殖核抗原Ki-67(cell proliferating nuclear antigen Ki-67，Ki-67)的表
达，为以ADAM17为靶点的乳腺癌靶向治疗提供新的方法。

1 材料与方法
1.1 主要材料30只雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，3周龄，16～20 g；25只雄性SD大鼠购自中国军事医学科学院卫生学环境医学
研究所，3周龄，60～80 g。

在SPF级屏障环境饲养室中饲养，26～28 ℃恒温，40%～60%相对湿度，实验操作人员经过严格的无菌培训，饮用水、垫料、笼具
均经消毒处理，饲料经高压灭菌处理，每日光照维持10、14 h无光的明暗周期。

慢病毒ADAM17-shRNA-RFP由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成。

人乳腺癌细胞(michigan cancer foundation-7,MCF-7)细胞株购自中国医学科学院天津
血液研究所。

1.2 BMSCs的分离、培养及慢病毒载体的转染将25只SD大鼠，用脱颈法处死，在75%的酒精中浸泡10 min，股骨取出后，剪断其两端，暴露骨髓腔，用空白培养液冲洗已分离股骨髓腔，收集骨髓细胞悬液。

2 000 r/min离心20 min，弃上
清液，用15% 胎牛血清的低糖DMEM细胞培养液制备成单细胞悬液。

随后加入
培养瓶中，添加含15% FBS、1%双抗的低糖DMEM培养液，置于培养箱中常规培养。

24 h后进行第一次半定量换液，72 h后进行常规全量换液，之后大约每隔3～5 d换液1次。

取第3代对数生长期BMSCs，制备成单细胞悬液，接种于共
聚焦小皿上，按照慢病毒转染说明书操作，以感染复数=5，于共聚焦小皿中加入
重组慢病毒转染液8～10 μl，放入独立的培养箱中培养。

24 h后换液，72 h后在激光共聚焦扫描显微镜下观察BMSCs的生长及转染情况。

1.3 建立裸鼠乳腺癌动物模型及治疗常规培养人MCF-7细胞。

选取3周龄的裸小鼠，从饲养第3天开始，每日向裸小鼠腹腔内注射雌激素0.2 ml/只(0.15 mg/ml)，直至处死裸鼠取标本；注射雌激素3 d后，开始用1 ml无菌注射器将现制的
MCF-7细胞悬液按0.2 ml/只(5×107 /ml)注射于裸小鼠右侧鼷皮下。

每天检查其
精神状态、饮食和活动、注射部位的感染情况以及移植瘤的生长情况。

MCF-7细
胞接种14 d后，30只裸鼠荷瘤瘤结节直径7 mm左右，裸鼠乳腺癌荷瘤动物模
型构建成功。

行靶向治疗，将30只裸小鼠随机分为转染组(注射1×106/ml转染ADAM17-shRNA的BMSCs)、BMSCs组(注射1×106/ml BMSCs)和对照组(注
射空白PBS)。

按照上述分组，采用无菌微量注射器通过尾静脉注射BMSCs和转
染ADAM17-shRNA的BMSCs，0.1 ml/次，每3 d重复给药一次，共5次。

从
第10天开始每日定时测量荷瘤的体积大小，记录数值，并算出移植瘤的体积以及最大抑瘤率：抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)×100%，并观察各组裸鼠的精神状态，饮食和活动度变化情况。

治疗16 d后均采用脱颈法处死。

1.4 肿瘤组织处理在超净台内，采用无菌手术器械分离瘤体，将瘤体组织置于4%多聚甲醛固定液中固定，然后石蜡包埋备用，待进行后续实验。

1.5 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE) 取出包埋蜡块，固定在
切片机上连续切片，切片厚度为4.5 μm，60 ℃恒温箱中烤片4 h，经脱蜡、水化、冲洗后，苏木精染液染色3～5 min，再冲洗、分化、反蓝，0.3%伊红染液染色2～3 min后，冲洗、脱水、二甲苯透明，滴中性树胶，加盖玻片封固。

光镜下观察组织的变化。

1.6 免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色取出载玻片先后经脱蜡、
水化、组织抗原热修复后，滴加3% H2O2在室温下孵育30 min。

血清封闭20 min，滴加兔抗人ADAM17抗体(1 ∶150)、兔鼠抗人EGFR抗体(1 ∶150)、兔抗人Ki-67抗体(1 ∶200)4 ℃孵育过夜。

第2天滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃静置30 min，PBS冲洗3次，5 min/次。

在DAB显色液中避光放置5 min，细
胞着色棕黄色为止，再用苏木精染色2 min，冲水反蓝，0.1%盐酸酒精脱去多余
底色后再次脱水,最后滴加中性树胶，加盖玻片。

用光学显微镜下查看染色结果并
采集照片。

染色结果用Image-Pro-Plus图像分析软件进行分析。

染色呈棕黄色为
阳性，ADAM17和EGFR阳性表达位于细胞胞质，Ki-67蛋白阳性表达位于细胞
核内。

结果用积分光密度值(integrated optical density,IOD)表示。

依据染色指
数统计结果，以染色分数(染色强度)评分和阳性细胞率评分评定结果。

染色指数(染色分数评分乘以阳性细胞率评分)<3分为阴性；≥3分为阳性。

1.7 统计学处理采用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行统计学处理。

计量资料
均采用表示，组间比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 BMSCs的形态结构及生长状态全骨髓贴壁培养法分离BMSCs，相差显微镜
下观察。

原代BMSCs可见细胞以梭形及多角形多见，细胞排列混乱，细胞集落较少。

第3代BMSCs可见大量贴壁细胞，细胞形态较一致，以长梭形为主，呈集落漩祸状分布，见图1。

图1 荧光显微镜下观察第3代BMSCs ×40A、B均为第3代BMSCs未染色荧光
透视图
2.2 慢病毒介导的ADAM17-shRNA转染BMSCs细胞用表达RFP的慢病毒介导将ADAM17-shRNA转染第3代BMSCs。

利用激光共聚焦荧光显微镜观察ADAM17-shRNA的转染效果。

根据BMSCs的红色荧光判断转染率达85%以上，见图2。

慢病毒介导的ADAM17-shRNA成功转染入BMSCs，且转染率较高，可以用于后续实验。

2.3 观察裸小鼠荷瘤的生长情况及抑瘤率 30只裸小鼠在皮下种植MCF-7细胞14 d左右，皮下种植部位有肿瘤隆起于皮肤表面，成瘤率达到100%，裸鼠乳腺癌造模成功。

治疗16 d后观察各组裸小鼠的瘤体体积大小，肉眼观察可见转染组移植瘤体积缩小，抑瘤效果明显，小鼠精神状态、进食可，未出现明显消瘦；而BMSCs组的移植瘤体积与对照组的移植瘤体积无缩小，增长较快，少数肿瘤出现
坏死、破溃，小鼠精状况、进食差，消瘦严重，并出现恶病质。

测量不同时间段裸小鼠移植瘤的体积变化情况，见表1。

实验结束时，转染组、BMSCs组、对照组
的移植瘤体积分别为(375.09±20.72)、(765.71±30.31)和(783.95±27.26)mm3，与对照组相比，转染组肿瘤体积变小，差异有统计学意义(P<0.05)，BMSCs组肿瘤体积变化不大，差异无统计学意义。

转染组、BMSCs组的抑瘤率分别为
52.09%、2.35%。

2.4 HE染色观察各组瘤体组织学形态变化 HE染色显示荷瘤裸鼠乳腺癌细胞呈腺
体样排列，细胞呈椭圆形或圆锥形，细胞核位于一侧，显著异型性，呈条索状分布，可见大量癌细胞形成椭圆形癌巢，浸润间质，并伴间质出血坏死现象，整体呈人乳腺浸润性导管癌的典型病理特征，见图3。

与对照组相比，转染组可见肿瘤组织大片坏死区域、坏死区域细胞崩解，细胞结构消失等，而BMSCs组则无明显改变。

2.5 IHC染色法检测各组瘤体ADAM17、EGFR和Ki-67的表达
2.5.1 转移瘤ADAM17的表达 ADAM17蛋白定位表达于细胞胞质，阳性反应呈
棕黄色染色反应。

其中尤以对照组阳性表达最强，BMSCs组与对照组染色大致相同，阳性表达较弱，见图4。

转染组、BMSCs组与对照组ADAM17蛋白的IOD
值分别为(4.91±0.43)、(6.97±0.39)、(7.24±0.52)。

与对照组相比较，转染组ADAM17蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(F=93.970,P<0.05)；而BMSCs 组无明显差异。

图2 激光共聚焦显微镜下观察ADAM17-shRNA的转染率A：透光图；B：荧光图；C：A和B的合并图；1：×200;2：×400表1 各组裸鼠的肿瘤体积大小
项目肿瘤平均体积18d22d26d30d转染组
119.58±17.19195.05±18.81*266.67±20.15*375.09±20.72*BMSCs组
132.50±23.00376.38±23.40545.20±28.51765.71±30.31对照组
138.45±17.12402.35±22.79570.37±23.27783.95±27.26F值
2.242296.760408.1401075.984P值0.0910.000.000.00与对照组比较: *P<0.05 图3 HE染色观察各组肿瘤组织的形态结构×100A：转染组；B：BMSCs组；C：对照组
图4 免疫组织化学染色法检测各组肿瘤组织ADAM17的表达×200A：转染组；B：BMSCs组；C：对照组
图5 免疫组织化学染色法检测各组肿瘤组织EGFR的表达×200A：转染组；B：BMSCs组；C：对照组
2.5.2 转移瘤EGFR的表达 EGFR蛋白定位表达于细胞胞膜和(或)胞质，阳性反应
呈棕黄色染色反应，其中尤以对照组阳性表达强，BMSCs组与对照组染色大致相同，阳性表达较强，见图5。

转染组、BMSCs组与对照组ADAM17蛋白的IOD
值分别为(7.86±0.38)、(9.86±0.40)、(10.15±0.53)。

与对照组比较，转染组EGFR蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(F=84.684,P<0.05)；而BMSCs组
无明显差异。

2.5.3 转移瘤Ki-67的表达 Ki-67蛋白定位表达于细胞胞核，阳性反应呈棕黄色染色反应，其中尤以对照组阳性表达强；BMSCs组与对照组染色大致相同，阳性表达较强，见图6。

转染组、BMSCs组与对照组蛋白的IOD值分别为(8.60±0.64)、(8.37±0.40)、(6.48±0.46)。

与对照组相比较，转染组Ki-67蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(F=58.024,P<0.05)；而BMSCs组无明显差异。

3 讨论
ADAM是近年来新发现的锚定于细胞膜表面，具有多种功能的糖蛋白家族，ADAM家族都包含有相对保守的区域。

主要参与神经发育、肌管融合和受精卵形
成等过程，ADAM还参与生物活性因子的释放、细胞融合、细胞基质的降解、细
胞-基质的粘连、细胞信号传导等一系列过程，因此ADAM蛋白家族与肿瘤的形
成和发展密切相关。

ADAM17属于ADAM蛋白家族的重要一员，ADAM17一方
面能够发挥蛋白剪切酶样的作用，从而剪切活化肿瘤坏死因子-α，另一方面还参
与多种EGFR配体(双调蛋白、肝素结合性表皮生长因子、表皮调节素和转化生长
因子α)等的水解释放过程，ADAM17通过剪切并释放多种EGFR配体，激活ErbB家族介导的信号级联传导系统，影响肿瘤的一系列生物学过程。

ADAM17
一方面具有剪切、活化细胞膜上肿瘤坏死因子-α的功能，另一方面还具有解聚素
和金属蛋白酶的活性。

ADAM17发挥蛋白剪切酶样作用，从而调节细胞的增殖、迁移运动等多种生物学行为，其在肿瘤发生、发展的整个过程中发挥着十分关键的作用。

此外，ADAM17还可通过剪切、水解Notch受体，将Notch受体的胞内
区转入胞核区，参与Notch信号传导通路的激活和转录，此信号通路参与肿瘤的
增殖、侵袭和转移等过程[6-9]。

EGFR是ErbB家族成员之一，属于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体。

EGFR是存在于细胞膜的跨膜糖蛋白分子，由原癌基因erb B1编码，erb B1定位于7p11～13，由28个外显子组成，编码分子量大小为
170 ku。

EGFR的胞外配体结合区与相应各种配体相结合后，引起胞外结构域的构象变化，形成异体二聚体结构，进而引起EGFR的磷酸化，以激活下游信号传导通路(RAS/RAF/MEK/ERK1/2通路、磷脂酶C通路、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号
通路)，从而调控细胞的分化、增殖和迁移等。

EGFR表达异常与多种恶性肿瘤(如
结直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌等)的发生密切相关[10-11]。

当前研究[12]普遍表明EGFR下游信号通路的激活与ADAM17在恶性肿瘤中的高表达存在着一定的关联性，并发现ADAM17在前列腺癌和脑胶质瘤细胞中高表达，且ADAM17是通过激活EGFR-PI3K-AKT信号传导通路，以促进前列腺癌细胞、脑胶质瘤细胞的快速增殖和生长[13]。

Ki67是与细胞增殖相关的核抗原，主要位
于细胞核内。

其抗原表达随细胞周期的变化而变化, 在G1后期出现，在S、G2期逐渐上升至M期达高峰，有丝分裂结束后迅速降解消失，静止G0期细胞不表达。

该蛋白通过复杂的方式与其他蛋白及DNA和RNA相结合，通过核内结构及空间
上的作用，是细胞分裂中核糖体合成的关键因子，对细胞增殖必不可少。

Ki-67作为常见恶性肿瘤的生物学检测指标，通过采用IHC等病理学检查方法[14]，检测
Ki-67的表达情况，以准确判断其增殖活性，其作为判定恶性肿瘤细胞增殖活性最可靠及最具代表性的一种检测指标，同时也为评估肿瘤的侵袭能力以及肿瘤患者预后提供了理论指标。

图6 免疫组织化学染色法检测各组肿瘤组织Ki-67的表达×200A：转染组；B：BMSCs组；C：对照组
病毒介导转运载体首先是把病毒基因组中的传染性和致病性等有害基因剔除后，再把外源的shRNA或外源基因整合到宿主染色体上，包装成为新的病毒载体，使其具有高效性、连续性地表达目的基因的效果。

以慢病毒为载体介导转运的RNAi技术已被广泛应用于基础研究，因慢病毒载体介导转运对基因表达的沉默具有更好的特异性和更显著的效果。

本研究首先针对目的基因ADAM17设计和合成
ADAM17-shRNA慢病毒表达载体，并且设计合成的慢病毒表达载体内部包含RFP的表达框架，转运入目标靶细胞后可以表达红色荧光，依据红色荧光可以判
断靶细胞的转染效率。

在肿瘤的基因靶向治疗方面，BMSCs展现了多方面的明显优势特点，BMSCs易于分离培养、稳定性强、体外转染率高、易于外源基因转染、免疫原性低、排斥反应小、迁移归巢肿瘤组织能力等，BMSCs以其独有的特征能够作为新一代肿瘤生物靶向治疗的载体。

本课题组前期研究探讨转染ADAM17-shRNA的BMSCs显著抑制乳腺癌细胞ADAM17的表达，同时也显著抑制细胞
的增殖能力和体外侵袭能力[15]。

因此，为进一步深入探讨，本研究在动物水平，利用裸小鼠乳腺癌荷瘤模型，将转染ADAM17-shRNA的BMSCs注射入裸小鼠
体内，探讨ADAM17-shRNA转染BMSCs对乳腺癌ADAM17、EGFR和Ki-67
基因的影响。

本实验结果显示转染组裸小鼠移植瘤体积明显缩小；HE染色镜下可见肿瘤组织大片坏死区域，坏死区域细胞崩解，细胞结构消失；并且转染组的
ADAM17、EGFR、Ki67蛋白表达量明显下降。

故可得出结论慢病毒介导ADAM17-shRNA转染BMSCs，具有抑制裸鼠乳腺癌ADAM17、EGFR和Ki-67的表达，同时发挥裸鼠体内乳腺癌抑瘤效果，为以ADAM17为靶点的乳腺癌靶向治疗提供新的方法。

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